Monitoreo adsorción de proteínas de estado sólido Nanoporos
2 de diciembre de 2011
Un método de utilización de estado sólido nanoporos para controlar la adsorción inespecífica de proteínas en una superficie inorgánica se describe. El método emplea el principio de resistencia de pulso, lo que permite la absorción que se probaron en tiempo real y en el nivel de moléculas individuales. Debido a que el proceso de adsorción sola proteína está lejos del equilibrio, se propone el empleo de arrays paralelos de nanoporos sintéticos, lo que para la determinación cuantitativa de la velocidad de reacción aparente
El objetivo general de este procedimiento es crear nanoporos en membranas artificiales para su uso en estudios de absorción de proteínas. Esto se logra perforando nanoporos en una membrana de nitruro utilizando un microscopio electrónico de transmisión (stem). Luego, el nanoporo se coloca en una cámara y se humedece con una solución iónica.
De modo que el líquido forma un puente desde un lado del nanoporo hasta el otro para preparar el nanoporo para los experimentos. Se aplica un voltaje a través de él y se puede observar un flujo de corriente iónica que pasa a través del mismo. El paso final consiste en añadir proteína a la cámara del nanoporo.
La observación final de bloqueos de larga duración en la corriente iónica a través del nanoporo revela la absorción de proteínas en los lados del nanoporo. Hola, soy Dave Wicki. Soy estudiante de posgrado en el Departamento de Física de la Universidad de Syracuse.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la absorción de proteínas en superficies inorgánicas, también puede aplicarse a otros sistemas, como las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos, la espectroscopía de molécula individual y el estudio de moléculas en espacios confinados. Comience elevando el microscopio hasta alcanzar un voltaje de aceleración.
A continuación, cargue una rejilla con ventana de nitruro de silicio SPI en el portamuestras de TEM. Limpie la rejilla con plasma de oxígeno durante 30 segundos para eliminar residuos. Antes de cargar la muestra, introduzca el portamuestras en el TEM y espere a que se alcance el vacío.
Utilizando el modo de microscopía electrónica de transmisión (TEM) en campo claro, localice la ventana de nitruro, un cuadrado brillante en la imagen en bruto. Asegúrese de que el TEM esté alineado correctamente. Luego, alinee y enfoque la muestra.
Ahora coloque el sistema en modo STEM y utilice un detector externo caliente para obtener una imagen de la muestra y verificar su alineación. Si está presente, configure el monocromador en un valor bajo, lo que permite una corriente mayor de electrones disponible para perforar. Seleccione el tamaño de punto adecuado para perforar el nanoporo según el diámetro del haz de electrones.
Con el vástago alineado. Utilice el BROGRAMA para enfocar perfectamente la membrana de nitruro a la ampliación requerida. Si hay algún movimiento de la muestra, apague el haz de electrones y espere a que la muestra se estabilice.
Esto puede llevar hasta una hora. Una vez estabilizado, coloque la sonda electrónica sobre la muestra e inicie la perforación del nanoporo. Perforar un nanoporo con un TM requiere paciencia e infidelidad.
Es un proceso en el cual el nitruro se disipa gradualmente bajo una sonda de haz de electrones. Es importante mantener la sonda de electrones directamente encima del sitio de perforación y confirmar que el nanoporo esté completamente perforado. Antes de retirar la muestra del microscopio electrónico de transmisión (TEM), verifique periódicamente la muestra escaneando con el detector caliente apagado.
Si la muestra se desplaza ligeramente, ajuste la posición del haz de electrones para que quede sobre el nanoporo. Con el gramo de ROI enfocado, la película de nitruro brillante desaparecerá. Cuando el nanoporo se forme con el gramo roky desenfocado, será visible el borde de difracción del clavo deshilachado.
Imagene el nanoporo con el haz de electrones apagado y realice un perfil de intensidad de la imagen. El diámetro del nanoporo puede estimarse a partir de la región más oscura del perfil. El haz de electrones puede utilizarse para agrandar el nanoporo si es necesario.
Cuando tenga el diámetro requerido. Cambie al modo TEM con el monocromador en la configuración estándar. Utilice el microscopio electrónico de transmisión en campo claro para confirmar el tamaño del poro.
Comience preparando la solución salina desgasificada. Somete la solución a vacío y sónicala en un baño durante 20 minutos. Coloque delicadamente el nanoporo frágil que contiene el chip de nitruro de silicio en un vaso de precipitados Pyrex de 10 mililitros. Luego, en una campana extractora, coloque el vaso en una placa calefactora.
Limpie con mucho cuidado el chip Nanopore con solución de piranha. Primero, agregue tres mililitros de ácido sulfúrico al recipiente utilizando una pipeta de vidrio. Segundo, agregue cuidadosamente un mililitro de peróxido de hidrógeno concentrado al ácido sulfúrico.
Tomar todas las precauciones. Deje que el chip de nanoporos se remoje durante 10 minutos. Luego, utilizando una pipeta de vidrio, retire la solución de piraña del vaso de precipitados y desecharla adecuadamente.
A continuación, llene el vaso de precipitados con agua desionizada Degas. Utilizando una pipeta de vidrio limpia, vacíe el vaso de precipitados de agua y repita este lavado al menos cinco veces. Con pinzas limpias, retire el chip de nanoporo y séquelo mediante succión suave.
Una vez seco, selle inmediatamente el chip de nanoporo en la cámara. El chip puede fijarse en la cámara mediante anillos tóricos u sellador de silicona. Llene la cámara con solución de cloruro de potasio.
Conecte los electrodos de plata y cloruro de plata a la cámara. Los electrodos pueden fabricarse sumergiendo un alambre de plata en lejía durante toda la noche. Aplique un potencial transmembrana a través de los electrodos y supervise la respuesta de corriente utilizando un amplificador de parche tipo clamp.
En el modo de bloqueo de voltaje, construya una curva de corriente-voltaje a partir de las mediciones. La curva debe ser altamente lineal. Al utilizar cloruro de potasio uno molar, la conductancia del nanoporo debe corresponder a su diámetro.
Si el nanoporo no muestra una curva IV lineal, la conductancia es demasiado baja o la corriente abierta del nanoporo no es estable. Esto indica que el nanoporo no está correctamente insertado y se debe repetir el lavado con piha. Es esencial asegurarse de que haya fluido dentro del nanoporo.
Si este paso no se realiza adecuadamente, la corriente iónica a través del nanoporo presentará un ruido muy elevado y la partición de las proteínas en el nanoporo se reducirá drásticamente. Comience añadiendo una muestra purificada de la proteína de interés en el baño conectado a tierra de la cámara. Espere a que la muestra se difunda completamente.
Aplique un voltaje de polarización de potencial transmembrana con polaridad opuesta a la de la carga total de la proteína que se está estudiando. Un potencial aplicado de 200 milivoltios debería ser lo suficientemente elevado como para observar. La mayoría de los eventos de analitos proteicos aparecerán como desviaciones transitorias de la corriente respecto a la línea base.
Si no se observa ninguna señal, aumente la concentración de la proteína en la cámara. Voltajes más altos mejoran la relación señal-ruido y el nitruro. Los nanoporos pueden soportar varios voltios.
Las absorciones de proteínas aparecerán como cambios de larga duración en la corriente de base del Nanoporos. Los resultados típicos para nanoporos de estado sólido serán los siguientes. La corriente del poro abierto debe ser altamente estable.
Las características IV del nanoporo deben ser altamente lineales. En cloruro de potasio un molar, fosfato de potasio 10 molar pH 7,4, la pendiente de un ajuste lineal a la curva IV proporcionará la conductancia unitaria del nanoporo. La conductancia tiene una relación directa con el diámetro del nanoporo y debe coincidir con la ecuación.
Este valor debe coincidir dentro del 30 %. Si el valor es demasiado pequeño, es probable que el poro no esté unido con la adición de proteína. Deben producirse eventos rápidos; la absorción de proteínas provoca una caída prolongada de la corriente. Algunas proteínas son altamente lábiles y experimentan transformaciones estructurales en el interior del poro.
En este caso, la caída de voltaje de larga duración irá acompañada de fluctuaciones rápidas. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar nanoporos de estado sólido utilizando un microscopio electrónico de transmisión de barrido, y de cómo utilizarlos para la absorción de proteínas SA. No olvide que trabajar con la solución piranha puede ser extremadamente peligroso, y que siempre deben tomarse precauciones como trabajar en una campana extractora con guantes, una bata de laboratorio y un delantal químico al realizar este procedimiento.
Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.
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Resumen
Este artículo describe un protocolo para fabricar nanoporos de estado sólido en membranas de nitruro de silicio y utilizarlos para estudiar la adsorción de proteínas a nivel de molécula individual. El método aprovecha la técnica del pulso resistivo para monitorear las interacciones de las proteínas con las superficies de los nanoporos, proporcionando información sobre la dinámica de adsorción de proteínas y permitiendo aplicaciones más amplias en espectroscopía de molécula individual y estudios moleculares en espacios confinados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- biofísica
- nanotecnología
- análisis de moléculas individuales
Antecedentes
- Los nanoporos de estado sólido se utilizan para analizar ácidos nucleicos, desnaturalización de proteínas y unión de ligandos a nivel de molécula individual.
- La técnica del pulso resistivo permite la detección sin etiquetas de interacciones del analito con nanoporos mediante el monitoreo de cambios en la corriente iónica.
- La adsorción de proteínas en las paredes de los nanoporos es cada vez más importante a medida que los dispositivos microfluídicos disminuyen de tamaño.
- Este protocolo puede adaptarse para diversas películas delgadas y superficies funcionalizadas.
Objetivo del estudio
- Crear y utilizar nanoporos de estado sólido para ensayos rápidos de unión de proteínas a películas de nitruro.
- Monitorear eventos de adsorción de proteínas en tiempo real mediante mediciones de corriente iónica.
- Proporcionar una plataforma versátil para estudiar interacciones proteína-superficie bajo diversas condiciones.
Métodos Utilizados
- Perforación de nanoporos en membranas de nitruro de silicio mediante un microscopio electrónico de transmisión con barrido (STEM).
- Limpieza y preparación de los chips de nanoporos con plasma de oxígeno y solución piraña.
- Ensamblaje del chip de nanoporos en una cámara y llenado con solución iónica (por ejemplo, cloruro de potasio).
- Aplicación de un potencial transmembranal y monitoreo de la corriente iónica con un amplificador de parche tipo clamp.
- Introducción de muestras de proteínas y observación de bloqueos de corriente indicativos de eventos de adsorción.
Resultados principales
- Fabricación exitosa de nanoporos con diámetros controlados, confirmada mediante imágenes de microscopía electrónica de transmisión y mediciones de conductancia.
- Características estables y lineales de corriente-voltaje (IV) en nanoporos adecuadamente humedecidos.
- Detección de bloqueos transitorios y de larga duración en la corriente, correspondientes a la partición y adsorción de proteínas.
- Capacidad para distinguir entre eventos rápidos y adsorción sostenida basándose en las firmas de corriente.
Conclusiones
- El protocolo permite la creación y el uso confiable de nanoporos de estado sólido para estudios de adsorción de proteínas.
- Proporciona un método sensible y sin marcadores para monitorear interacciones de moléculas individuales con superficies inorgánicas.
- El enfoque es adaptable a una variedad de proteínas, superficies y condiciones experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos con nanoporos en estado sólido permiten la monitorización directa y sin marcadores de la adsorción de proteínas a nivel de molécula individual, abordando desafíos clave en la comprensión de las interacciones proteína-superficie para la investigación y desarrollo en biofármacos&D. Esta capacidad es cada vez más vital a medida que la miniaturización de dispositivos amplifica el impacto de la adsorción de proteínas en plataformas microfluídicas y analíticas. La integración de análisis basados en nanoporos respalda la confianza predictiva y la reducción de riesgos mecanicistas en las etapas iniciales de descubrimiento y en las líneas de desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las interacciones proteína-superficie relevantes para la comprobación de hipótesis terapéuticas.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al revelar la dinámica de adsorción en diversas condiciones de solución.
- Facilita la validación funcional del comportamiento de las proteínas sobre superficies inorgánicas y funcionalizadas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un ensayo rápido y cuantitativo para la unión de proteínas a películas delgadas de nitruro y otras.
- Ofrece lecturas reproducibles y libres de marcadores adecuadas para la estandarización entre plataformas.
- Prepara sistemas validados para cribado de compuestos y flujos de trabajo analíticos posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Permite explorar la estabilidad y adsorción de proteínas en entornos confinados relevantes para el desarrollo de dispositivos.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la caracterización de interacciones proteína-material.
- Ofrece información predictiva sobre el comportamiento de las proteínas en sistemas microfluídicos y diagnósticos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este ensayo basado en nanoporos se integra en la continuidad desde el descubrimiento temprano hasta el desarrollo del ensayo, proporcionando datos fundamentales para la identificación de compuestos activos y el diseño preclínico de dispositivos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración mecanicista de las interacciones proteína-superficie.
- Cribado Permite la evaluación cuantitativa y reproducible de la adsorción de proteínas para la preparación del ensayo.
- Análisis: Proporciona mediciones de corriente a nivel de molécula individual y firmas de eventos de adsorción para análisis comparativo.
- Investigación traslacional Se alinea con el desarrollo preclínico de dispositivos al modelar el comportamiento de proteínas en entornos confinados y relevantes para los dispositivos.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a una variedad de proteínas, superficies y condiciones experimentales para una amplia R&D utilidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de proteínas y materiales.
- Valor operativo: Proporciona ensayos estandarizados, escalables y reproducibles a nivel de molécula individual.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar y reduce el riesgo en fases avanzadas del desarrollo de dispositivos y ensayos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos proteicos y plataformas de dispositivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de nanoporos y en el análisis de corriente a nivel de molécula individual.
- Necesita acceso a microscopía electrónica y equipos de parche adherido (patch clamp).
- Exige protocolos rigurosos de limpieza y estandarización para lograr reproducibilidad.
- Es adaptable a diversas películas delgadas y superficies funcionalizadas, según lo permita la perforación de nanoporos.
- Las precauciones de seguridad son fundamentales al manipular reactivos peligrosos para la limpieza.
