Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo
14 de enero de 2012
Se muestra el método para realizar microscopía intravital del bazo con las buenas prácticas agrarias parásitos de la malaria transgénicos y la cuantificación de la movilidad del parásito y el flujo de sangre dentro de este órgano.
En este procedimiento, mostramos un enfoque cuantitativo de microscopía intravital para evaluar la dinámica del paso del parásito a través del bazo. En un modelo de malaria en roedores, se preparan ratones infectados con parásitos transgénicos GFP para la microscopía intravital; la canulación de la vena esplénica permitirá la inyección de colorantes intravitales. Durante el experimento, se obtienen imágenes de células fluorescentes en movimiento en diferentes áreas del bazo.
Proporcionamos la metodología para describir la movilidad del parásito en el compartimento lento tridimensional del pulpa roja y calculamos el flujo sanguíneo en los vasos. Estos parámetros se utilizaron para comparar la dinámica esplénica de dos cepas de PULE. Hola a todos.
Me llamo Nando El Portillo y una de las principales preguntas de investigación en mi laboratorio es tratar de comprender el papel del bazo en la malaria. La esplenomegalia es uno de los signos característicos de esta enfermedad, pero debido a problemas técnicos y éticos, realizar estudios sobre este órgano es muy difícil. Para lograrlo, hemos implementado tecnologías que nos permiten observar el paso dinámico de este parásito y cuantificar estos fenómenos.
Esto es lo que Lorena y MI explicarán en estos protocolos. Esta investigación se está llevando a cabo en parte en colaboración con los grupos del Dr. Ler de la Universidad de Hamburgo en Alemania y de la Dra. Maria Kbo en el Hospital Clínic, y ha recibido financiamiento general de la fundación Cellex y del ministerio CIA. La infección en español se inicia a partir de un donante M infectado con parásitos GFP letales o no letales al 10 % de parásitos. Para verificar el parásito, tome una pequeña gota de sangre de la vena de la cola del ratón y extiéndala sobre un microscopio.
Deslice una tinción métrica con GIMs. Una solución permitirá la visualización de glóbulos rojos infectados una vez secos; fije el extendido sanguíneo con metanol durante dos minutos, aplique la solución de GIMs e incube durante 20 minutos. Lave el portaobjetos con agua corriente del grifo y seque; enumere el porcentaje de GBIs sobre el total de GRs utilizando un microscopio óptico con objetivo de inmersión de cien aumentos.
Infecte ratones con parásitos letales o no letales obtenidos de la sangre de la cola de ratones donantes diluidos en PBS. Ajuste la dosis para inyectar medio millón de parásitos por ratón con el fin de alcanzar un parásito periférico del 1% al tercer día postinfección e inyecte por vía intraperitoneal. Alternativamente, se pueden usar glóbulos rojos marcados con FITC como control.
Los animales recolectan un mililitro de sangre arterial de un ratón y lavan el botón celular mediante centrifugación en PBS que contiene EDTA; luego se suspenden en solución de FITC e incubar durante dos horas en la oscuridad con agitación suave. Transcurrido ese tiempo, elimine el sobrenadante por centrifugación y lave exhaustivamente. Inyecte en un ratón control para obtener un promedio de 1% en la circulación periférica y continúe con los experimentos in vivo.
Hola, soy Mija. Para obtener imágenes del bazo in vivo, necesitamos realizar una pequeña cirugía en el animal para exponer el bazo, obviamente esta técnica. La aprendí de Stephanie GR en el laboratorio de la investigadora Heisler, a quien me gustaría agradecer, y ahora les mostraré cómo proceder.
Imagen de miosis infectada realizada al tercer día postinfección, cuando el porcentaje de parásitos es del 1% en ambas cepas. Mantenga al ratón anestesiado y a temperatura regulada durante todo el procedimiento. Proteja los ojos de la deshidratación y verifique que el ratón esté completamente anestesiado pinchando la planta del pie antes de continuar, con el fin de facilitar la administración intravenosa de sustancias.
Durante el transcurso del experimento, canule la vena caudal del ratón para construir la cánula. Inserte una aguja pequeña en un extremo de un tubo y su aplicador en el otro extremo. Cargue la cánula con solución salina fisiológica eliminando las burbujas, y verifique que la solución fluya correctamente a través de la cánula.
Se canulará limpiamente la vena lateral de la cola. Mejore su visibilidad realizando una ligera constricción en la base de la cola. Introduzca la punta de la cánula dentro de la vena.
La aparición de sangre indicará que la aguja está bien posicionada. Si no lo está, repita la canulación aguas arriba de la vena y luego fije la cánula a la cola utilizando pegamento y cinta adhesiva. Exponga la parte inferior del bazo mediante una pequeña incisión en la piel y la musculatura en el lado dorsal izquierdo del animal.
Coloque un bazo donde se observe menos movimiento respiratorio y aplique PBS sobre la superficie expuesta para mantenerla libre de pelo de ratón y hidratada. Selle el bazo con un cubreobjetos para permitir la visualización. Hola, mi nombre es Lorena.
El protocolo mostrado nos permitirá visualizar el movimiento de los parásitos PULI a través del bazo. Esto ha sido posible gracias a los parásitos transgénicos GFP. Donación amable de James Burnes de la Universidad Drexel.
El estudio del movimiento de parásitos fluorescentes nos permitirá conocer si existen diferencias en el comportamiento entre cepas letales y no letales. Los experimentos de microscopía intravital se realizaron en un microscopio multiphotónico Leica, equipado con un sistema de incubación con control de temperatura y un objetivo de glicerol de 63x. Coloque el animal sobre la platina del microscopio con el bazo cubierto con un cubreobjetos orientado hacia abajo, en dirección al objetivo. Inicialmente.
La visualización del bazo a aumentos más bajos proporcionará una vista general de la estructura microcirculatoria del órgano. Enfocar el bazo utilizando la autofluorescencia del tejido; se observan parásitos GFP pasando a través de las diferentes áreas del bazo. Hola, mi nombre es Maria Albo de los Centros Científicos y Tecnológicos de la Universidad de Barcelona, y realizaremos imágenes intravital del bazo.
Con el fin de estudiar el flujo sanguíneo y la movilidad de los glóbulos rojos infectados, utilizaremos un microscopio confocal equipado con un escaneo resonante que permite imágenes de alta velocidad, muy útil para evitar el movimiento del órgano. Se trata de un microscopio espectral que permite seleccionar el rango de visión. Para obtener imágenes muy rápidas, realizaremos la adquisición simultánea de las dos fluoresceínas, marcaciones y reflexión.
Seleccione diferentes zonas para obtener imágenes con la ayuda de los colorantes RBC, de reflexión, de contraste y de Vidal para evidenciar la microvasculatura del bazo. Ahora explicaremos cómo medir la movilidad del parásito en el flujo sanguíneo del vaso mediante microscopía Vidal y el software ImageJ para seguir el movimiento del parásito en la red tridimensional de la pulpa roja. Adquiera imágenes a través de cinco profundidades en Z utilizando un modo de escaneo de alta velocidad.
Convierta pilas de imágenes en películas codificadas por Z en color para facilitar el seguimiento de células fluorescentes individuales. En el texto se proporciona información detallada para rastrear diferentes partículas a lo largo del tiempo según la profundidad en cada video; utilizando coordenadas X, Y, Z y T, se pueden calcular parámetros de movilidad como la direccionalidad, la velocidad media y el tiempo de residencia, y representarlos como mapas de distribución para permitir un análisis comparativo entre poblaciones de cepas. El flujo vascular en el bazo puede visualizarse mediante la inyección sistémica de varias moléculas fluorescentes descritas en la tabla complementaria, como la dextrina.
Y utilizando el contraste de reflexión de eritrocitos endógenos, escanee el flujo sanguíneo central colocando los vasos horizontalmente en la dirección del barrido láser y empleando el promedio de líneas mejorado. En estas imágenes, las trazas resultantes de las células en movimiento se utilizarán para calcular el flujo sanguíneo; tome imágenes de vasos con diferentes diámetros y a lo largo del ciclo cardíaco para compensar las fluctuaciones. Durante mucho tiempo, el bazo ha sido considerado una caja negra en la investigación de la malaria, y aquí desarrollamos un enfoque cuantitativo de microscopía intravital para obtener información sobre la dinámica de la infección por parásitos y el flujo sanguíneo en este órgano, lo que nos permite abordar preguntas biológicas importantes, como la adhesión in vivo de los glóbulos rojos infectados al bazo.
Gracias y.
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Descripción general
Este estudio demuestra un enfoque cuantitativo de microscopía intravital para evaluar la dinámica de los parásitos de la malaria en el bazo. Mediante parásitos de la malaria transgénicos GFP, se cuantifica la movilidad de los parásitos y el flujo sanguíneo dentro del bazo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Microscopía
Antecedentes
- La microscopía intravital permite la obtención de imágenes en tiempo real de procesos biológicos.
- Comprender la dinámica de los parásitos en el bazo es fundamental para la investigación de la malaria.
- Los parásitos transgénicos GFP proporcionan una marca visual para rastrear sus movimientos.
- La dinámica del flujo sanguíneo puede influir en el comportamiento del parásito y en la respuesta inmunitaria.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la movilidad de los parásitos de la malaria en el bazo.
- Evaluar la dinámica del flujo sanguíneo en relación con el movimiento de los parásitos.
- Comparar la dinámica esplénica de diferentes cepas de malaria.
Métodos Utilizados
- Modelo de malaria en roedores utilizando ratones infectados con parásitos transgénicos GFP.
- Microscopía intravital del bazo con canulación venosa para la inyección de colorante.
- Imagen de células fluorescentes en movimiento en diversas áreas del bazo.
- Cuantificación de la movilidad del parásito y de los parámetros del flujo sanguíneo.
Resultados principales
- Metodología detallada para evaluar la movilidad del parásito en el bazo.
- Comparación de la dinámica esplénica entre dos cepas de PULE.
- La visualización de células fluorescentes proporciona información sobre el comportamiento del parásito.
- Datos cuantitativos sobre la dinámica del flujo sanguíneo en el bazo.
Conclusiones
- El estudio proporciona un marco para comprender la dinámica del parásito de la malaria.
- La microscopía intravital es una herramienta poderosa para el análisis en tiempo real.
- Los hallazgos podrían orientar futuras investigaciones y estrategias de tratamiento contra la malaria.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía intravital cuantitativa del bazo permite la medición directa de la movilidad del parásito de la malaria y del flujo sanguíneo in vivo, abordando un vacío crítico en la comprensión de las interacciones huésped-patógeno a nivel orgánico. Esta capacidad respalda la reducción de riesgos mecanicistas y la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento, especialmente para la validación de dianas en enfermedades infecciosas y la evaluación funcional. El enfoque proporciona datos accionables para la triage y priorización de carteras, así como de modelos relevantes para la enfermedad en la investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de las interacciones parásito-huésped dentro de un contexto orgánico fisiológicamente relevante.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de la adherencia y movilidad del parásito in vivo.
- Proporciona información mecanicista que orienta la confianza predictiva y la reducción de riesgos biológicos.
- Facilita el análisis comparativo de diferentes cepas de parásitos para la priorización de objetivos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece flujos de trabajo validados de imagen y cuantificación para el cribado posterior de intervenciones antiparasitarias.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles, como la velocidad, la direccionalidad y el tiempo de residencia de los parásitos.
- Permite la estandarización de las condiciones del ensayo mediante herramientas de análisis de código abierto como ImageJ.
- Prepara sistemas biológicos robustos para la evaluación confiable de compuestos en modelos de animales vivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea modelos in vivo relevantes para la enfermedad con el desarrollo de biomarcadores traslacionales para la investigación de la malaria.
- Garantiza la continuidad desde estudios mecanicistas en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de hipótesis terapéuticas.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la provisión de lecturas cuantitativas a nivel de órganos.
- Mejora la desestimación predictiva de riesgos para carteras de enfermedades infecciosas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de microscopía intravital se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, conectando estudios mecanicistas iniciales con la validación de modelos traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la movilidad y adherencia del parásito, aclarando las vías huésped-patógeno en el bazo.
- Selección: Proporciona salidas de imágenes cuantitativas estandarizadas para el desarrollo de ensayos y pruebas de compuestos.
- Análisis: Ofrece métricas de velocidad, direccionalidad y tiempo de residencia para un análisis comparativo riguroso.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de imágenes in vivo con estrategias de biomarcadores relevantes para la enfermedad en la malaria.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable de imágenes y análisis para diversos modelos de enfermedades infecciosas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagen y cuantificación para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y mejora la eficiencia del capital al reducir riesgos en programas de etapas iniciales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de modelos relevantes para las enfermedades.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía intravital y análisis cuantitativo de imágenes.
- Necesita acceso a plataformas de imagen avanzadas y software analítico de código abierto.
- Exige una estandarización entre equipos para la generación e interpretación reproducible de datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes modelos animales o agentes infecciosos.
- La complejidad técnica y el manejo de animales deben cumplir con las normas éticas e institucionales.
