Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este artículo en video describe un procedimiento para obtener perfiles de glicosilación de 20 glicoproteínas diferentes en una muestra de suero de paciente con carcinoma hepatocelular, utilizando primero una matriz microperforada de anticuerpos bloqueada químicamente. Los anticuerpos específicos para glicoproteínas se imprimen directamente sobre láminas para microarreglos, y los glicanos de los anticuerpos se bloquean para evitar la unión de lectinas. Cuando se aplican muestras de suero del paciente, las glicoproteínas de la muestra son capturadas por los anticuerpos. Luego se añaden proteínas de unión a glicanos biotiniladas para detectar los glicanos, y se añade estreptavidina doblemente conjugada para marcar las lectinas biotiniladas.

La lámina de microarreglo se escanea luego para detectar fluorescencia; el análisis de los datos resultantes revela los perfiles de glicosilación de las proteínas de la muestra. Esta técnica presenta varias ventajas frente a métodos existentes como la HPLC. Este método permite la detección de glicoproteínas individuales en su estado nativo.

Es más rápido y sencillo analizar simultáneamente la alteración de la glicosilación en múltiples proteínas. Bien, descubrimos que los biomarcadores de enfermedades, particularmente del cáncer y del cáncer de hígado, que hemos estudiado con mayor detenimiento, suelen estar glicosilados. Y hallamos que la capacidad de detectar formas glicadas específicas mejora considerablemente el desempeño de los biomarcadores en cuanto a sensibilidad y especificidad.

Por lo tanto, esta medida puede proporcionar información sobre las alteraciones de la glicosilación en múltiples proteínas séricas en el CHC. También puede aplicarse al estudio de la patología y al descubrimiento de biomarcadores en otros tipos de cáncer y enfermedades, como el cáncer de páncreas, la diabetes y la enfermedad de Alzheimer. El procedimiento será demostrado por Chen Lu, un técnico de mi laboratorio.

Comience este protocolo preparando primero la matriz de anticuerpos en tubos microcetrífugos de 0,8 mililitros sobre hielo; diluya todos los anticuerpos que se utilizarán para la impresión de la matriz hasta una concentración de 0,5 miligramos por mililitro en un mínimo de 40 mililitros de PBS. Aquí, se utilizarán 26 anticuerpos diferentes como control positivo. Prepare también la misma cantidad de BSA biotinilada a 0,5 miligramos por mililitro en PBS. Utilice una pipeta para aliquotar 40 mililitros de cada anticuerpo en la placa fuente de 384 pocillos sobre hielo.

Luego, en el software de control del microarreglo, designe la ubicación de cada anticuerpo. A continuación, cargue la placa en el microarreglo como fuente. Luego, cargue 20 portaobjetos de microarreglo de trayectoria en el microarreglo como destino.

Configure el microarreglo para imprimir 48 subarreglos idénticos en los que 27 anticuerpos y proteínas de control se depositen en tríplica en un patrón de nueve por nueve. Inicie el microarreglo para imprimir las láminas de microarreglo de anticuerpos. Recolecte las láminas de microarreglo de anticuerpos y guárdelas en un estuche para láminas con desecante.

Cierre el cassette en una bolsa de plástico para prevenir la desnaturalización de proteínas y la humedad en los portaobjetos durante el almacenamiento. Almacene los portaobjetos de microarreglo sellados a cuatro grados Celsius hasta su uso. El aspecto más difícil e importante de este procedimiento es el paso de bloqueo químico.

Para garantizar el éxito, es fundamental que se imprima una cantidad suficiente de anticuerpo sobre la matriz microscópica. Siempre prepare ácido yodoacético sódico y hidrocito ácido nítrico frescos inmediatamente antes del experimento. Y asegúrese de llevar a cabo el procedimiento de oxidación a cuatro grados evitando la luz.

Saque las láminas de microarreglo del refrigerador y déjelas equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire una lámina de la caja de almacenamiento. Súmérjala brevemente en un recipiente con PBS que contenga 0,1 % de Tween 20.

Luego, sumerja el portaobjetos en tampón de acetato de sodio 15 milimolar con 0,1 % de tween durante 10 minutos. A continuación, prepare una solución fresca de periodato de sodio 150 milimolar en tampón de acetato de sodio 15 milimolar, y transfiérala a una cubeta para lavado de portaobjetos. Guárdela en refrigeración, protegida de la luz hasta su uso. Retire el portaobjetos del tampón de acetato de sodio y colóquelo en la cubeta que contiene el periodato de sodio fresco con el lado del anticuerpo hacia arriba.

Cubra el recipiente con papel de aluminio para evitar la luz. Luego coloque el recipiente con portaobjetos a cuatro grados Celsius con agitación suave durante dos horas. Retire el portaobjetos del recipiente y enjuáguelo brevemente en tampón de acetato de sodio tres veces durante cinco minutos.

Incubar la portaobjetos en 300 mililitros de solución bloqueante de ácido hidroglutámico 10 milimolar recién preparada, en una cámara de incubación durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave. Retirar las portaobjetos de la cámara y lavarlas con PBS con tween al 0,1% durante tres minutos. A continuación, en un recipiente para lavado de portaobjetos, incubar la portaobjetos de microarreglo en 300 mililitros de BSA al 1% en PBS con tween al 0,5% durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave.

Lave las laminillas en PBS con Tween al 0,1 % tres veces durante tres minutos cada una. Coloque la laminilla en una rejilla para laminillas y centrifugue a 1.200 × g durante dos minutos para secar la laminilla de microarreglo. Para separar cada subarreglo, se imprime una cuadrícula de cera sobre la laminilla.

Después de precalentar el impresor de cera a 70 grados Celsius durante cinco minutos, coloque la laminilla de microarreglo bloqueada en el impresor de cera con el lado de los anticuerpos orientado hacia la cera. Tire suavemente del mango para imprimir cera uniformemente sobre la laminilla. Este método puede utilizarse para realizar ensayos de perfilado de glicoepítopos en una sola muestra o para medir un único epítopo glico en múltiples muestras.

Aquí demostraremos ensayos de perfilado de glico. Comience diluyendo 40 microlitros de suero en 360 microlitros de PBS que contenga 0.1% de tween, 0.1% de bridge 35 y 100 microgramos por mililitro, de cada una de las IgG de ratón, rata, conejo, cabra y asno. Este volumen es suficiente para aplicar seis microlitros de la solución de suero diluida sobre cada submatriz.

Aplique cuidadosamente seis microlitros de la muestra diluida o del control a cada submatriz del portaobjetos. Incube el portaobjetos en un cassette humedecido con toallas de papel húmedas a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague el portaobjetos con PBS al 0,1 % de tween tres veces durante tres minutos cada vez.

Luego seque la laminilla centrifugándola a 1200 veces G durante dos minutos. Prepare 20 microlitros de las proteínas de unión a glicanos biotiniladas a 10 miligramos por mililitro en PBS con tween en un tubo microfuga de 0,8 mililitros sobre hielo. Aplique seis microlitros de las lectinas biotiniladas diluidas a cada submatriz de la laminilla e incube en la caja para laminillas humedecida con toallas de papel húmedas a temperatura ambiente durante una hora.

Después de lavar las laminillas con PBS con 0,1 % de tween tres veces como antes, seque la laminilla centrifugándola a 1200 × g en una centrífuga durante dos minutos. Prepare 400 microlitros de neutreven marcado con DITE 5 49 al 10 miligramos por mililitro en PBS con 0,1 % de tween en un tubo microfuge de 0,8 mililitros sobre hielo. Utilice una pipeta repetidora para aplicar seis microlitros de neutreven marcado con DITE 5 49 sobre cada submatriz e incube la laminilla en la caja portaobjetos humedecida a temperatura ambiente durante una hora tras la incubación.

Lave la laminilla con PBS al 0,1 % de Tween tres veces durante tres minutos cada una. Seque la laminilla centrifugándola a 1200 × g durante dos minutos. Escanee la laminilla utilizando un escáner de microarreglos de fluorescencia con una resolución de 10 milímetros.

La configuración del láser y del PMT debe ser lo más intensa posible asegurando al mismo tiempo que no se observe saturación. Abra la imagen en Array Pro 3.2. Configure la plantilla de matriz según el mapa de matriz que muestra las ubicaciones de los puntos de anticuerpos.

Alinee cuidadosamente cada círculo de plantilla con el punto correspondiente en la imagen, y extraiga la intensidad de cada punto en un archivo de Excel para su posterior análisis. Se diseñó y fabricó un microarreglo de anticuerpos que contiene 48 subarreglos idénticos con 26 anticuerpos contra 20 glicoproteínas séricas y biotina, así como BSA, según se describe en este video, para examinar la importancia del procedimiento de bloqueo.

En el análisis del perfilado de glicoproteínas, se generaron dos microcristales idénticos. Uno no fue bloqueado químicamente, mientras que en el otro se aplicó una muestra control en las micromatrices de las columnas uno y tres, y una muestra de suero de HCC agrupada se aplicó en las micromatrices de las columnas dos y cuatro 22.

Después, se aplicaron lectinas biotiniladas específicas para diferentes glicanos sobre cada submatriz, como se muestra en estas imágenes de las submatrices. Las lectinas se unieron a los anticuerpos de captura en las columnas de control, generando un fondo elevado que no se podía distinguir de las columnas cargadas con suero en las micromatrices no bloqueadas. Sin embargo, cuando se realizó el mismo experimento en una micromatriz de anticuerpos bloqueada químicamente, no hubo o hubo muy poca unión a los anticuerpos de captura en las columnas de control y una unión elevada al antígeno en las columnas cargadas con suero.

Estos resultados demuestran que el procedimiento de bloqueo químico es un paso crítico para la medición de glicanos en glicoproteínas capturadas por anticuerpos. Siguiendo el protocolo, se pueden obtener los perfiles de glicosilación de 22 glicoproteínas en suero de HCC una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en ocho horas si se lleva a cabo correctamente. Los anticuerpos, cuando están modificados, pueden perder su afinidad por sus antígenos y otras propiedades.

Por lo tanto, es importante tenerlo en cuenta y utilizar varios anticuerpos diferentes provenientes de distintas fuentes siguiendo este procedimiento. Otras medidas, como la detección de la concentración de cada proteína mediante el uso de la misma lámina de micromatriz, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como si la alteración de la glicosilación se debe al cambio en los niveles de expresión proteica o únicamente a la alteración de la glicosilación en cada proteína individual. No olvide que trabajar con muestras de suero que contienen patógenos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes protectores, al realizar este procedimiento.