Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría
21 de noviembre de 2012
La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.
El objetivo de este procedimiento es medir el transporte inverso de dopamina en una neurona que está fijada en voltaje mediante la técnica de "patch clamp" simultánea y pirrometría para medir la liberación de dopamina mediada por DAT. Esto se logra primero probando la integridad del electrodo pirrométrico con dopamina. El segundo paso consiste en colocar el electrodo pirrométrico cerca de la célula y establecer un "patch" de célula completa de la neurona con una pipeta de registro.
A continuación, el voltaje de la célula se controla mediante la pipeta de parche y se registra simultáneamente la dopamina liberada por la célula mediada por el DAT con un electrodo pirométrico. El paso final consiste en añadir el inhibidor del DAT y registrar nuevamente las corrientes de célula completa y pirométricas, para permitir la sustracción de la corriente mediada específicamente por el transportador de dopamina. La importancia de esta técnica radica en la capacidad de medir el transporte inverso de dopamina a través del transportador de dopamina mientras simultáneamente se controla el voltaje de la neurona dopaminérgica.
El sistema simultáneo de registro de clampaje de parche y barometría requiere un microscopio invertido con óptica DIC excelente y un objetivo de larga distancia de trabajo para generar una fuente de luz DC para el sistema. Con bajo ruido eléctrico, conecte el faro del microscopio a una batería de automóvil. Se utilizan micromanipuladores hidráulicos porque no contribuyen significativamente a los niveles de ruido en nuestra configuración.
Se utiliza un manipulador diestro para el bloqueo de voltaje y la grabación en célula íntegra, y un manipulador zurdo para la pirometría. Para preparar el electrodo para la grabación en célula íntegra, tire de una pipeta de cuarzo con un extractor P 2000. Normalmente, utilizamos una pipeta con una resistencia de tres a cuatro megaohmios.
A continuación, llene el electrodo con la solución de pipeta que contiene dopamina de un milimolar. Luego, colóquelo en el soporte de pipeta del manipulador derecho. Asegúrese de envolver el recipiente que contiene la solución de pipeta con dopamina con papel de aluminio y manténgalo en hielo cuando no esté en uso.
Dado que la dopamina es oxidable, mantener la solución en hielo y protegida de la luz reducirá la tasa de oxidación. Pase el alambre de plata por el soporte del electrodo y luego enrosque el adaptador am paramétrico en el soporte del electrodo. A continuación, llene el electrodo tric con suficiente mercurio para que haga contacto con el alambre de plata.
Cuando se monte el electrodo en el adaptador, asegúrese de inspeccionar bajo el microscopio la fibra de carbono de bajo ruido pro CFE y el electrodo paramétrico para verificar que la punta esté limpia e intacta. Asegúrese de sostener el extremo opuesto de la fibra de carbono para proteger la punta de la fibra de carbono de daños. Luego, monte el electrodo Tric pro CFE.
Posteriormente, monte el electrodo ensamblado en el manipulador hidráulico izquierdo para examinar la integridad del electrodo tric. Bájelo hasta un platillo de vidrio de fondo de vidrio que contenga la solución externa. Registre la corriente basal en ausencia de dopamina.
Luego, agregue 10 microlitros de una solución de dopamina de un milimolar al recipiente. Un electrodo amperométrico adecuado debe registrar un aumento en la corriente oxidativa. Asegúrese de verificar la integridad del electrodo amperométrico antes y después de los experimentos.
En este procedimiento, retire las neuronas dopaminérgicas o células modificadas para expresar el transportador de dopamina colocadas en la placa de Petri con fondo de vidrio del incubador. Lave suavemente las células o neuronas dopaminérgicas tres veces con solución externa tibia. Para visualizar las células y realizar el experimento, coloque la placa de Petri con fondo de vidrio sobre la platina del microscopio y encuentre el punto focal correcto para visualizar claramente las células.
A continuación, aplique presión positiva al electrodo de registro. Utilizando una jeringa de un mililitro, introduzca suavemente ambos electrodos en la solución y acérquelos a la célula mediante los micromanipuladores. Luego, coloque el electrodo métrico a la izquierda de la célula y el electrodo de registro a la derecha.
Cuando el electrodo de registro esté tocando la célula, aplique succión ligera mediante la boca o una jeringa para formar un sello gigaseal sobre la célula. A continuación, rompa el sello mediante succión para lograr la configuración de célula íntegra y permita de cinco a ocho minutos para la diálisis de la solución interna que contiene dopamina dentro de la célula.
Luego registre las corrientes mediadas por DAT mediante un escalón del voltaje de la membrana celular entre menos 60 y más 100 milivoltios desde un potencial de mantenimiento de menos 40 milivoltios a través de la pipeta. Para determinar el flujo específico de dopamina mediado por DAT, registre las corrientes amperométricas en ausencia y presencia de un antagonista de DAT. La corriente trifásica específica mediada por DAT se determina entonces restando las trazas registradas en presencia del antagonista de DAT de las trazas amperométricas registradas sin el antagonista.
Una desviación ascendente en las corrientes tricorresponde a un flujo saliente de dopamina mostrado aquí. Corrientes mediadas por DAT registradas mediante el aumento del voltaje de la membrana en 20 milivoltios entre -60 y +100 milivoltios desde un potencial de mantenimiento de -40 milivoltios, con la pipeta conteniendo dopamina 2 milimolar en el modo de parche en célula completa. Aquí se muestra la corriente métrica Emper adquirida simultáneamente con la corriente en célula completa.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el transporte inverso de dopamina mediante el transportador de dopamina en una neurona con voltaje controlado. Recuerde verificar la integridad del electrodo paramétrico antes y después de los experimentos, y no olvide restar las trazas registradas en presencia del antagonista de las trazas registradas sin el antagonista.
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Descripción general
Este artículo describe una técnica para medir el transporte inverso de dopamina en neuronas mediante el acople simultáneo de registro con micropipeta y pirografía. El método permite evaluar la liberación mediada por el transportador de dopamina (DAT) mientras se controla el voltaje de la neurona.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Dinámica de neurotransmisores
Antecedentes
- La dopamina es un neurotransmisor fundamental implicado en diversas funciones cerebrales.
- El transportador de dopamina desempeña un papel clave en la regulación de los niveles de dopamina.
- Comprender los mecanismos de transporte inverso es esencial para obtener conocimientos sobre la señalización dopaminérgica.
- Esta técnica combina el bloqueo de voltaje con mediciones amperométricas para mejorar la precisión.
Objetivo del estudio
- Medir el transporte inverso de dopamina en neuronas con voltaje controlado.
- Investigar la relación entre la actividad del transportador de dopamina (DAT) y la liberación de dopamina.
- Proporcionar un método para estudiar la función de las neuronas dopaminérgicas en tiempo real.
Métodos Utilizados
- Evaluar la integridad del electrodo voltamétrico con dopamina.
- Obtener un parche de célula íntegra del neutrón utilizando una pipeta de parche.
- Controlar el voltaje celular mediante la pipeta de parche.
- Registrar la liberación de dopamina mediada por DAT utilizando el electrodo voltamétrico.
Resultados Principales
- Medición exitosa de la liberación de dopamina durante el bloqueo de voltaje.
- Se demostró el efecto de los inhibidores del DAT sobre el transporte de dopamina.
- Proporcionó información sobre los mecanismos reguladores del transporte de dopamina.
- Se validó el método para estudiar la dinámica neuronal de la dopamina.
Conclusiones
- La técnica mide eficazmente el transporte inverso de dopamina.
- El control simultáneo del voltaje mejora la comprensión de la función del DAT.
- Este método puede aplicarse a estudios adicionales sobre la señalización dopaminérgica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la medición directa del eflujo de dopamina a través del transportador de dopamina bajo control de voltaje, proporcionando una comprensión mecanicista de la función del transportador relevante para el descubrimiento de fármacos neuropsiquiátricos. Al aislar la liberación mediada por DAT en tiempo real, apoya la validación del blanco terapéutico y reduce los riesgos asociados a hipótesis sobre la señalización dopaminérgica en modelos de enfermedad. El enfoque mejora la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento al vincular la actividad del transportador con la dinámica de los neurotransmisores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza el mecanismo de eflujo del transportador de dopamina para validar el compromiso funcional del blanco en neuronas vivas.
- Valor operativo: Permite la grabación simultánea electrofisiológica y amperométrica para correlacionar el potencial de membrana con el flujo de dopamina mediado por el transportador.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y resueltas en el tiempo de corriente oxidativa que reflejan la liberación de dopamina dependiente de DAT bajo pasos de voltaje controlados.
- Valor operativo: Establece un formato de ensayo reproducible para medir el eflujo mediado por transportadores, facilitando la selección de compuestos moduladores de DAT.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la actividad de ef flujo de DAT con la homeostasis extracelular de dopamina, aportando información para modelos de enfermedades en los que se sospecha disfunción del transportador.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para enfermedades para evaluar perturbaciones genéticas o farmacológicas de la función del transportador de dopamina.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la eliminación de riesgos mecanicistas en los blancos del transportador de dopamina antes de los esfuerzos de identificación de compuestos activos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos de inversión del transportador y la aclaración de vías en neuronas dopaminérgicas.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantitativas listas para ensayos, para evaluar los efectos de compuestos sobre la efusión mediada por DAT.
- Análisis: Ofrece mediciones simultáneas de corriente total de célula y amperometría para aislar señales específicas de DAT mediante sustracción farmacológica.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de la disregulación de la dopamina en sistemas neuronales con control de voltaje.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la función del transportador en múltiples modelos neuronales o contextos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco al medir directamente la liberación de dopamina mediada por eflujo bajo control fisiológico de voltaje.
- Valor operativo: Favorece la estandarización del ensayo mediante la sincronización de la técnica de patch clamp y la amperometría, reduciendo la variabilidad en las mediciones del flujo de neurotransmisores.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al aclarar el mecanismo de acción del transportador, reduciendo la eliminación tardía por malentendidos mecanicistas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos dirigidos al DAT basada en datos funcionales de modulación del eflujo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, amperometría y cultivo neuronal para mantener la integridad del electrodo y la fidelidad de la señal.
- Depende de instrumentación de bajo ruido, incluyendo manipuladores hidráulicos, amplificadores duales Axopatch 200B y electrodos de fibra de carbono para grabaciones simultáneas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de voltaje y de los métodos de sustracción con antagonistas para garantizar la comparabilidad entre experimentos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes modelos neuronales, particularmente respecto a los niveles de expresión del transportador de dopamina y la salud de la membrana.
- Incluye limitaciones prácticas, como la oxidación de la solución de dopamina, que requiere manipulación protectora y validación de la línea base antes y después de los experimentos.
