Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

El objetivo general del experimento FollowMe consiste en registrar la actividad de disparo neural de un gran número de neuronas. Esto se logra observando, en una primera etapa, el aumento en la concentración de calcio intracelular en el soma neuronal asociado a cada potencial de acción mediante microscopía de fluorescencia. Se utiliza la excitación por dos fotones y un principio de escaneo de acceso aleatorio para registrar señales fluorescentes de calcio procedentes de 40 somas neuronales con una alta resolución espacial y temporal.

En el segundo paso, los momentos exactos de los potenciales de acción se extraen de las señales fluorescentes mediante un algoritmo de desconvolución. Esta técnica puede utilizarse para registrar la actividad de disparo de decenas de neuronas. Los datos de actividad de disparo luego pueden emplearse para medir la información mutua, la propagación de señales entre poblaciones neuronales o las correlaciones neuronales.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las grabaciones con microelectrodos es que permite registrar la actividad de disparo de un gran número de neuronas pertenecientes a una población local. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la función cortical a nivel de redes neuronales locales, como la importancia de las correlaciones en la búsqueda de información y los cambios en la dinámica de las redes con la corticoplasticidad. Para la excitación con dos fotones, se utiliza un sistema láser de pulsos infrarrojos con pulsos de femtosegundos. Se requiere una alta potencia de salida del láser para compensar las grandes pérdidas introducidas por los componentes ópticos del sistema.

Un precompensador por sistema compuesto por dos prismas imprime una dispersión negativa de la velocidad grupal sobre los pulsos láser antes de los deflectores ópticos personalizados, para compensar la dispersión temporal introducida por los AOD. Dos AOD con aperturas grandes desvían el haz láser en dos dimensiones. Una rejilla de difracción reflectante con 100 surcos por milímetro se coloca a 13 centímetros detrás de los AOD para compensar la dispersión espacial introducida por los mismos. Al utilizar pulsos láser cortos, el haz láser se dirige mediante dos telescopios de relevo hacia el puerto de la cámara de un microscopio invertido.

Los iris se colocan a intervalos regulares para la alineación de los componentes ópticos. Un divisor de haz dicróico situado delante del objetivo transmite la luz de excitación infrarroja hacia la muestra y refleja la luz de fluorescencia proveniente de la muestra hacia un detector. Los detectores de fluorescencia epiescopia y transiluminación recogen la señal de fluorescencia a través del objetivo, y filtros de vidrio coloreado del condensador se colocan delante de los detectores para evitar que la luz de excitación llegue a estos.

Los ángulos de desviación de la DOA están controlados por una computadora equipada con una tarjeta convertidora digital-analógica, que a su vez acciona osciladores controlados por voltaje. La señal proveniente de los fotomultiplicadores se transmite a través de un filtro paso bajo Butterworth con una frecuencia de corte de 100 kilohercios y es digitalizada por un convertidor analógico-digital a una velocidad de reloj de 156,25 kilohercios antes de ser almacenada en una computadora para su análisis. La alineación y el ruido eléctrico se prueban registrando la distribución de las señales fluorescentes con y sin luz láser, a ganancia baja y alta de los fotomultiplicadores, así como con y sin indicador. El escaneo aleatorio con acceso aleatorio depende de la detección de aumentos intracelulares de calcio. El primer paso del protocolo consiste en teñir un gran número de neuronas con la forma de éster de un indicador de calcio mediante inyección en bolo.

A continuación, registre la actividad del soma en cada neurona en cuatro ubicaciones durante 6,4 microsegundos en cada ubicación. Para seleccionar las neuronas de interés, adquiera un cuadro completo compuesto por 256 por 256 píxeles. Luego, seleccione manualmente los centros de las neuronas que se registrarán dentro de esta imagen.

El software de control agrega automáticamente tres puntos a una distancia de dos micrones alrededor de cada centro en cada ciclo. Se registra la señal fluorescente desde las cuatro ubicaciones en todas las 40 neuronas. El registro desde todas las neuronas en un ciclo requiere 1,536 milisegundos.

Repita esta grabación secuencial de las 40 neuronas durante cinco segundos. La detección de picos a partir de señales fluorescentes de calcio somático depende de una alta relación señal-ruido. Una alta relación señal-ruido puede lograrse aumentando la intensidad de excitación.

Sin embargo, la intensidad de excitación solo puede aumentarse hasta un límite determinado debido al daño fotónico. Existe solo una ventana muy pequeña de intensidad de excitación en la que el daño fotónico es bajo y la relación señal-ruido es suficiente para detectar picos individuales, con el fin de asegurar que las señales registradas se encuentren dentro de la ventana de alta detección de picos. Durante un experimento, se utilizan varios programas de análisis en línea desarrollados por nuestro laboratorio.

A continuación, calcule la tasa aproximada de fotones por neurona a partir de una ventana temporal corta del ruido de línea base de aproximadamente 100 a 200 milisegundos. El número de fotones y la tasa de fotones se calculan a partir de los valores de fluorescencia ajustando la distribución de los cambios relativos de fluorescencia con esta ecuación, luego calcule la fluorescencia de línea base a partir de la misma ventana temporal y represéntela como una función del tiempo o de los ensayos. Mantenga el declive promedio de la línea base por debajo de 0,0002 por segundo ajustando la potencia del láser.

Debido a que la detección de picos disminuye rápidamente al superar este límite. Después de eso, verifique las posiciones somáticas de las neuronas cada 10 a 20 minutos adquiriendo una imagen de cuadro completo. Ajuste las ubicaciones de grabación si es necesario.

Las señales fluorescentes resultantes de la actividad neuronal a menudo se solapan en el tiempo debido al largo decaimiento del transitorio de calcio. En este procedimiento, se utiliza un método de desconvolución para recuperar los picos y los tiempos de los picos a partir de las señales fluorescentes. Aquí usamos un algoritmo genético para determinar el modelo de tren de picos más probable que se ajuste a la señal fluorescente registrada.

Con cada iteración del algoritmo, la verosimilitud máxima se aproxima asintóticamente a su valor máximo, determinado por el ruido de las grabaciones de fluorescencia. En poblaciones neuronales heterogéneas, la señal de calcio inducida por un potencial de acción puede variar entre neuronas. Para el análisis no supervisado de grandes conjuntos de datos, diseñamos un algoritmo que tiene en cuenta la variación de la señal de calcio inducida por potenciales de acción de una neurona a otra, con el fin de evitar un gran número de detecciones falsas positivas.

La distribución conjunta de la amplitud y la constante de tiempo de decaimiento del transitorio de calcio evocado por un potencial de acción único se registra en un conjunto separado de experimentos realizados con el mismo tipo de neuronas y bajo las mismas condiciones experimentales. Para tener en cuenta los cambios lentos en la línea base y reducir los costos computacionales de la desconvolución, las grabaciones más largas se dividen en varios trazos más cortos de uno a cinco segundos para cada neurona en cada registro; el algoritmo de desconvolución puede probar un gran número de modelos, hasta 1 millón de modelos diferentes o más. Para acelerar la desconvolución, un experimento se desconvoluciona en hasta 10 computadoras diferentes en paralelo.

Después de la desconvolución, se analizan e inspeccionan los datos de picos. De manera automatizada, se calcula la probabilidad de picos en el histograma peri estímulo y la frecuencia de disparo del neurona. A continuación se muestran ejemplos de una señal fluorescente registrada con una tasa de excitación muy baja y otra con una tasa de excitación muy alta dentro de la ventana de detección.

Téngase en cuenta que cada ejemplo muestra la respuesta a un solo potencial de acción. Aquí se muestra una micrografía fotográfica de un corte cerebral agudo y dos pipetas de estimulación colocadas en la misma columna cortical. En la capa cuatro, se observan las respuestas neuronales a los estímulos repetitivos, y en esta gráfica se muestra la información mutua de Shannon señalada por la población registrada de neuronas.

Aquí se muestra la medición de la propagación de la actividad de disparos superumbral entre diferentes poblaciones de neuronas corticales. Estos son los disparos detectados en neuronas corticales, en respuesta a la estimulación eléctrica de las fibras talamocorticales. Al registrar la actividad neuronal mediante escaneo de acceso aleatorio, es muy importante registrar dentro de la ventana de detección.

De lo contrario, es muy fácil terminar con conjuntos de datos inutilizables. La detección óptica de picos aún se encuentra en sus inicios. Existe un gran margen de mejora.

Con algunos mejoras, registramos de aún más neuronas. Con otras mejoras, incluso podremos registrar en animales despiertos y con comportamiento activo.