La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

El objetivo general de este procedimiento es extraer LPS de bacterias Gram-negativas. Esto se logra primero cultivando un caldo de cinco mililitros de bacterias durante la noche en un medio adecuado y ajustando la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros a 0,5. A continuación, las bacterias se sedimentan mediante microcentrifugación y las células se resuspenden en un tampón tris que contiene SDS y beam o etanol capto.

Luego, los lisados celulares se someten a ebullición y se tratan con proteasa y nucleasa. Finalmente, se realizan dos extracciones secuenciales con fenol acuoso caliente y éter dietílico, eliminando cuidadosamente y conservando la capa acuosa azul. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cantidad y la presencia o ausencia de LPS y cepas bacterianas, así como la modalidad de la longitud de la cadena del antígeno O, mediante separación por electroforesis SDS-PAGE y análisis western blot con anticuerpos específicos para LPS o tinción directa de los polisacáridos en el gel.

La ventaja de esta técnica en comparación con el tratamiento con proteasa de Hitchcock y Brown es que este método produce muestras de LPS puras que pueden separarse mejor mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y transferencia para inmunodetección (western blot). Este método puede proporcionar información sobre la síntesis y regulación del lipopolisacárido en prácticamente cualquier bacteria gramnegativa, incluyendo Escherichia coli y Salmonella, así como patógenos de interés en bioseguridad y emergentes como Yersinia y Acetobacter, respectivamente. Para cultivar bacterias, prepare una cultura sobrenocturna de bacterias gramnegativas en cinco mililitros de caldo LB suplementado con antibióticos.

Si es necesario, incubar el cultivo durante la noche en un incubador con agitación a 200 RPM y 37 grados Celsius. Utilizar LB para diluir el cultivo uno a 10, y luego medir la densidad óptica a 600 nanómetros según el resultado. Preparar una suspensión de 1,5 mililitros de las bacterias con una densidad óptica final a 600 nanómetros de 0,5.

Centrifugar las bacterias en una microcentrífuga a 10.600 × g durante 10 minutos. Luego, retirar y desechar el sobrenadante. Para extraer el LPS, preparar las siguientes soluciones: un tampón XSDS, etanol al 4 % con beta-mercaptoetanol o BME 4 % SDS, y glicerol al 20 % en Tris-HCl 0,1 molar pH 6,8 con una pizca de azul de bromofenol y soluciones de 10 miligramos por mililitro de DNAasa, RNAasa y proteinasa K en agua destilada estéril para resuspender.

Las bacterias en pelotón en 200 microlitros de tampón 1 XSDS aseguran que el precipitado se resuspenda completamente mediante pipeteo repetido de la solución hacia arriba y hacia abajo. Hervir lentamente las bacterias suspendidas en un baño de agua durante 15 minutos. Luego, dejar enfriar la solución a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Como paso opcional, agregue cinco microlitros de cada una de las soluciones de ADN 1 y ARN e incube las muestras a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Agregue 10 microlitros de la solución de proteasa K e incube las muestras a 59 grados Celsius durante tres horas. A continuación, agregue a cada muestra 200 microlitros de fenol frío saturado con tris.

Cierre herméticamente las tapas y vortexe cada tubo durante cinco a 10 segundos. Incube las muestras a 65 grados Celsius durante 15 minutos. Durante la agitación por vortex, enfríe ocasionalmente hasta temperatura ambiente.

Luego, bajo una campana extractora, agregue un mililitro de éter etílico a temperatura ambiente a cada muestra y vortexee durante cinco a 10 segundos. Centrifugue las muestras a 20 600 ×g durante 10 minutos y retírelas cuidadosamente del centrifugador. Extraiga la capa inferior azul de cada muestra, evitando la capa superior clara.

Añada 200 microlitros adicionales de tris frío con hielo, fenol saturado y repita la extracción en cada tubo. Añada 200 microlitros de tampón 2X SDS. Separe de cinco a 15 microlitros de cada muestra de LPS en geles de poliacrilamida SDS al 8-15%.

Se muestra aquí un gel de electroforesis SDS al 12 % de muestras de LPS preparadas a partir de diferentes cepas de bur cold area de losa, aisladas de muestras de esputo de pacientes con fibrosis quística. Los diferentes patrones de bandas reflejan el distinto número de unidades repetitivas de antígeno O unidas a los oligosacáridos centrales. Se puede observar un número similar de unidades repetitivas en las muestras uno y seis.

No olvide que trabajar con éter difenílico puede ser peligroso; se deben tomar precauciones como usar equipo de protección personal, como una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras, y estos experimentos deben realizarse en una campana extractora al llevar a cabo este procedimiento. Es importante realizar las extracciones rápidamente para no perder las muestras durante el procesamiento. Después de este procedimiento, se deben emplear inmunotransferencias Western u otros métodos para visualizar el lipopolisacárido mediante tinción argéntica STR u otros métodos, con el fin de observar la relación entre cepas.