Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de "Cierre de seguridad" Metodología

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar un péptido BSP funcionalizado utilizando técnicas de fase sólida. Esto se logra cargando un aminoácido BIS protegido sobre una resina de ácido hidroxietilbenzoico. Luego, se repiten ciclos de acoplamiento con protección profunda para unir aminoácidos bis funcionalizados, un proceso que alarga el péptido BIS y expone la funcionalidad deseada.

Finalmente, el primer aminoácido bis se modifica con un aminoácido alfa para escindir el péptido BIS de la resina mediante la formación de una pirazina DI cetónica. Los resultados obtenidos muestran la síntesis exitosa de un péptido BSP funcionalizado con buena pureza bruta y rendimientos aislados consistentes de aproximadamente 10 %, según el análisis por espectrometría de masas con cromatografía líquida. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la síntesis paralela y de bibliotecas de péptidos bis, ya que los péptidos BIS se ensamblan sobre una resina sólida, lo que facilita su manipulación en comparación con reacciones en solución, y los subproductos se eliminan fácilmente por filtración.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que muchos de los pasos son difíciles de aprender debido a que existen muchos detalles importantes necesarios para asegurar que todas las reacciones se acerquen lo más posible a su finalización. En la síntesis en fase sólida, no existe manera de purificar los intermedios. Por lo tanto, para obtener un producto final puro, cada reacción debe impulsarse tanto como sea posible.

Se recomienda crear una lista de verificación de los procedimientos experimentales para evitar confusiones, ya que los pasos son de naturaleza repetitiva. Este protocolo comienza con la carga del primer péptido BSP, la protección del primer péptido BSP y la capsulación simultánea de la resina. Para iniciar, cargue el primer péptido BSP pesando 114 miligramos de resina H-M-B-A-A en un vaso de reacción de ocho mililitros y agregue una barra magnética de agitación.

Tape la parte superior del recipiente con el septum de goma y purgue el tubo con Argón durante al menos cinco minutos. Mientras tanto, prepare la solución de aminoácido BIS activado según se describe en el protocolo escrito. Junto con este video, transfiera la solución al recipiente de reacción mediante una jeringa y agite bajo Argón durante la noche. Al día siguiente, retire el septum y drene la mezcla de reacción.

Lave la resina añadiendo aproximadamente dos mililitros de clorometano a la resina. Agite durante 30 segundos a un minuto y luego drene. Repita este proceso cuatro veces con DCM y luego lave la resina cinco veces con dimetilformamida.

Para realizar la desprotección profunda del primer bisaminoácido y la cappingulación simultánea de la resina, agregue lentamente dos mililitros de una solución de 33% de bromuro de hidrógeno en ácido acético y DCM al recipiente de reacción. Deje agitar durante 15 minutos tras drenar y lavar la resina cinco veces con DCM. Repita la secuencia de desprotección D una vez más.

A continuación, lave la resina cinco veces con DCM seguido de cinco veces con DMF, neutralice la resina lavando dos veces con la solución al 5% en volumen de D-I-P-E-A en DMF. Luego lave cinco veces con DCM y cinco veces más con DMF. Ahora se puede realizar el acoplamiento del bis aminoácido funcionalizado protegido.

Primero, reintroduzca una atmósfera inerte al recipiente de reacción que contiene la resina mediante tres lavados con DCM anhidro. Luego, coloque un septo y purgue y lave el recipiente con una línea de argón, agregando de uno a dos mililitros de DCM anhidro y agitando durante 30 segundos. A continuación, drene el recipiente hasta que comience a subir el burbujeador de la línea de argón.

Repita este proceso al menos una vez más. A continuación, prepare una solución de bis aminoácido funcionalizado en un tubo de ensayo secado con llama bajo atmósfera de argón. Añada 47 microlitros de DIC y agite durante 90 minutos.

Luego, agregue 35 microlitros de D-I-P-E-A en 666 microlitros y DMF Hydrus a la resina y agite durante cinco minutos adicionales. Transfiera la solución de aminoácido BIS previamente activada al recipiente mediante jeringa y agite durante la noche el día siguiente. Drene la mezcla de reacción y lave dos veces con DCM anhidro bajo argón.

Un paso crítico en este procedimiento son los acoplamientos de aminoácidos biz. Para garantizar el cierre de los anillos de dipeptidas cíclicas diketo, empleamos tiempos de reacción más largos con agentes activadores adicionales. Para favorecer el cierre de la diketopirazina, añada una solución de HOAT y DIC y agite bajo argón durante una hora.

A continuación, retire el septum y drene la mezcla de reacción. Lave la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. Esta sección abarca la protección profunda del aminoácido BIS funcionalizado, la protección profunda de F moc y la acilación del primer aminoácido BIS.

Para realizar la protección profunda del bisaminoácido funcionalizado protegido, agregue lentamente dos mililitros de una solución de TFA y TIPS al recipiente de reacción y agite durante una hora tras el drenado; lave la resina con DCM durante aproximadamente 30 segundos y luego drene, repita el lavado con DCM cinco veces. A continuación, repita toda la secuencia de lavado de resina para protección profunda siguiendo el lavado A-D-C-M-D-M-F. Neutralice la resina lavando dos veces con una solución al 5% volumen/volumen de D-I-P-E-A en DMF.

Luego, realice otro lavado D-C-M-D-M-F. A partir de este punto, el péptido BIS puede alargarse con otros aminoácidos bis funcionales o funcionarse en el ácido carboxílico del nitrógeno terminal, o ambas cosas. Para desproteger el grupo FM, agregue una solución de dos mililitros de piperidina al 20% en DMF y mezcle la reacción durante 20 minutos.

Drenar y lavar la resina cinco veces con DMF. Repetir este proceso una vez más tras un lavado adicional de la resina. A aislar el primer bis aminoácido añadiendo la solución de aminoácido preparada al recipiente de reacción y agitar durante seis horas como paso final.

Lave la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. La etapa final de este protocolo incluye la eliminación del grupo Bach del aminoácido unido a la resina y la escisión de la resina. Primero, añada dos mililitros de una solución de T-F-A-D-C-M uno a uno al vaso de reacción y agite durante 30 minutos.

Drene y lave la resina cinco veces con DCM. Luego repita este proceso una vez más. Lave y drene la resina durante 30 segundos, cinco veces con DCM y cinco veces con DMF.

A continuación, agregue dos mililitros de una solución de 10 % D-I-P-E-A en DMF anhidro y agite durante 24 a 48 horas. Finalmente, recoja la mezcla de reacción en un matraz redondo previamente pesado. Transfiera 30 microlitros de esta solución a 450 microlitros de Tetra Hydro FU en un vial de LC-MS y envíela para análisis.

Lave la resina con alícuotas adicionales de DMF y recupere en el matraz redondo. Los siguientes métodos pueden utilizarse para monitorear las transformaciones químicas en la resina durante toda la síntesis. Para detectar grupos hidroxilo libres, realice la prueba del rojo de metilo extrayendo primero aproximadamente un miligramo de resina seca mediante pipeta desechable.

Lave en un recipiente de reacción de cuatro mililitros. Añada una solución de rojo de metilo preparada como se describe en el texto y agite durante cinco a 10 minutos. Drene y lave la resina cinco veces con DCM; las perlas de resina de color naranja o rojo indican la presencia de grupos hidroxilo libres.

Esta prueba puede utilizarse para evaluar la carga del primer aminoácido bis y los pasos de sellado de la resina. Para detectar aminas secundarias, realice la prueba del cloral transfiriendo aproximadamente un miligramo de resina seca a un vial pequeño mediante pipeta desechable. Añada tres gotas de la solución de cloral 0,8 milimolar en DMF y tres gotas de la solución de aldehído ácido al 2% en DMF.

Y dejemos reposar a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. En este caso, las perlas de resina de color azul o púrpura indican que hay aminas secundarias libres presentes en el compuesto unido a la resina. Para confirmar las eficiencias de activación, realice la prueba de atrapamiento de activación; el compuesto activado durante la síntesis puede evaluarse transfiriendo de cinco a 10 microlitros de la solución activada a un vial de cromatografía líquida con espectrometría de masas que contenga 50 microlitros de olaina mezclados manualmente.

Durante unos segundos, la solución debe volverse amarilla, luego diluir con 450 microlitros de tetrahidrofuran y someter a análisis por LC-MS. El producto final y los intermedios activados pueden evaluarse utilizando un sistema LCM S equipado con una columna C 18 de fase reversa y un sistema de disolventes de agua acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico. Este cromatograma L-C-M-S-U-V proporciona un ejemplo de la buena pureza del producto bruto.

El pico principal en el espectro encontrado a los 21,3 minutos presenta una máscara consistente con la masa esperada del producto. Esto puede visualizarse en el espectro de masas del producto crudo, donde el pico revela picos principales correspondientes a la masa, más la masa del ion sodio, así como la masa menos la masa del grupo protector IV DDE. Aquí se muestra el cromatograma UV de LCMS de los espectros purificados, que revela un producto muy puro a los 21,3 minutos, y el espectro de masas confirma la identidad de este pico trier purificado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar técnicas de síntesis en fase sólida para obtener bis péptidos funcionalizados tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los bis péptidos exploraran aplicaciones en interacciones proteína-proteína y catálisis una vez dominada. Esta técnica puede permitir la síntesis de un trímero de bis péptido funcionalizado en cuatro o cinco días si se realiza adecuadamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las perlas sumergidas en las soluciones de reacción y lavado siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la síntesis paralela o la síntesis de bibliotecas, para responder preguntas adicionales, como el efecto de la estereoquímica o de funcionalidades alternas sobre la unión a proteínas o la actividad catalítica. No olvide que trabajar con reactivos orgánicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo adecuado de seguridad personal y una campana extractora, al realizar este procedimiento.