El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

El objetivo del siguiente procedimiento es demostrar cómo mantener los lisosomas de dos tipos de muestras, embriones de ratón y células madre diferenciadas, con el colorante lyo tracker para detectar patrones de muerte celular. Para preparar las muestras de embriones, primero se aíslan quirúrgicamente los embriones y se colocan en un recipiente para preparar las células diferenciadas. Las células madre embrionarias se utilizan para crear cuerpos embrionarios.

Estos cuerpos embrionarios se cultivan en suspensión y luego se crecen como una monocapa sobre un portaobjetos con cámara. La monocapa de células embrionarias puede incubarse en Ot Tracker rojo, luego se enjuagan las muestras, se fijan y se pueden fotografiar para examinar y cuantificar los resultados de tinción, los cuales muestran Liso Tracker. La tinción es un procedimiento sencillo que puede utilizarse para evaluar la muerte celular programada en embriones y células en cultivo.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el análisis de túnel radica en que, dado que el colorante OT tracker es una molécula pequeña, los tejidos gruesos pueden analizarse rápida y fácilmente. Aunque este método puede proporcionar información sobre los patrones de muerte celular programada en embriones de ratón y cultivos diferenciados, también puede aplicarse a otros tipos de tejidos, como embriones de pollo y células madre adultas en diferenciación. Aparee ratonas jóvenes con un macho reproductor y, en las mañanas siguientes, revise la presencia de un tapón vaginal, lo que indica que el apareamiento ha ocurrido.

El mediodía del día en que aparece el tapón vaginal equivale efectivamente a 0,5 días. Después del coito, en el día embrionario de interés, sacrificar a la hembra según protocolos aprobados y extraer el útero a una placa de Petri de 10 centímetros con BSS de Hank y eliminar cualquier rastro de sangre. Separar los embriones y retirarlos del útero.

Retire las membranas extraembrionarias y realice al menos un lavado con BSS de Hank para eliminar tejidos y sangre extraños. Mantenga los embriones diseccionados en hielo durante la limpieza. Los otros.

Prepare cinco mililitros de solución de tinción de embriones con Liso tracker. Este volumen es suficiente para una o dos recolecciones de embriones. Mezcle suavemente la solución para dispersar el colorante, luego transfiera los embriones a la solución e incúbelos a 37 grados Celsius durante 45 minutos.

Después de la incubación, enjuague suavemente los embriones en BSS de Hank cuatro veces, durante cinco minutos cada lavado. Es importante realizar los lavados con suavidad para no dañar el tejido. Retire el líquido lentamente, prestando mucha atención a la ubicación de los embriones delicados y asegurándose siempre de dejar una porción del líquido que los cubra.

Luego, fije los embriones en paraformaldehído al 4 % durante la noche al día siguiente. Lave los embriones una vez con BSS de Hank durante 10 minutos para eliminar el fijador. Ahora deshidrate los tejidos mediante una serie de metanol para eliminar la tinción de fondo.

Este paso mejora la relación señal-ruido durante la imagen previa al almacenamiento. Si es necesario, recolecte una muestra de tejido de cada embrión para análisis genético. Posteriormente, rehidrate la muestra de tejido antes de la genotipificación.

Separar los embriones en tubos individuales con etiquetas que coincidan con la muestra de tejido. Ahora es posible almacenar los embriones aislados indefinidamente en metanol a menos 20 grados Celsius. Protegidos de la luz.

Comience preparando cuerpos embrionarios mediante el método de gota colgante. Con una densidad inicial de 500 células por gota de 20 microlitros, transfiera los cuerpos embrionarios a cultivos en suspensión en placas de Petri no adherentes de 10 centímetros después de tres días. Incúbelos durante cinco días, cambiando el medio cada dos días a partir de los cinco días.

Transfiera los cuerpos embrionarios a portaobjetos de ocho cámaras gelatinizados, colocando uno o dos cuerpos embrionarios en cada cámara. Cultive los cuerpos embrionarios durante otros 10 días. Después de 10 días, cambie el medio cada dos días: aspire suavemente el medio existente y agregue 300 microlitros de solución de tinción de células con Lyo tracker a cada cámara.

Tenga cuidado al pipetear manualmente el medio, colocando la punta de la pipeta en la esquina de la cámara. De esta manera, no eliminará accidentalmente los cuerpos, que aún se están adhiriendo, de la superficie de vidrio. Al volver a añadir el medio, coloque la punta de la pipeta en la esquina de la cámara y agregue el medio muy lentamente.

Incube las cámaras a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, enjuáguelas dos veces con DPBS durante cinco minutos por cada enjuague. Ahora, fije las células en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Luego elimine el fijador con DPBS en dos lavados de cinco minutos cada uno. Para montar los embriones, colóquelos en una lámina de vidrio con cavidad profunda o en un pequeño escudo de infección para placa de Petri. Prepare las muestras celulares para microscopía aspirando el DPBS.

Retire la cámara del portaobjetos y déjela secar al aire durante aproximadamente cinco minutos. Cúbrala con papel de aluminio para proteger el fluorocromo. Luego, agregue un medio acuoso para montaje, como Vector Shield con DAPI, y coloque una laminilla encima.

Ahora el portaobjetos ha sido montado y está listo para la obtención de imágenes. Visualice las muestras con un microscopio estereoscópico o compuesto equipado con un filtro rojo, domine o Texas red. La tinción suele ser bastante intensa, por lo que generalmente no son necesarias exposiciones largas en modo manual.

Tome fotos digitales de todas las muestras bajo las mismas condiciones de exposición. Para cuantificar las imágenes, ábralas en Adobe Photoshop o un programa de procesamiento de imágenes similar. Para determinar la cantidad de tinción con el marcador lyo, seleccione el canal rojo.

Observe el número de píxeles de la imagen completa tal como lo muestra la función de histograma. A continuación, umbralice la imagen de modo que la tinción roja quede representada por píxeles blancos. Esto convierte la imagen a blanco y negro.

Seleccione un nivel de umbral y utilice este nivel para todas las imágenes del conjunto. Seleccione los píxeles blancos utilizando la herramienta de rango de color y use la función de histograma para obtener el recuento total de píxeles blancos. Utilice el canal azul para contar el número de núcleos en el campo.

Puede ser útil mantener un registro del conteo mediante la anotación de la imagen, registrar los valores y utilizarlos para calcular el nivel medio de tinción por célula. Repita este análisis con el mismo valor umbral para todas las imágenes restantes. Para el muestreo, se utilizó ly o tracker para teñir embriones mutantes de sonic hedgehog.

Dado que el rastreador de ly O es una molécula pequeña y altamente difusible, las áreas profundas en el interior del embrión completo teñidas a los 10,5 días post coito mostraron una muerte celular programada o PCG considerablemente aumentada en embriones mutantes nulos para sonic hedgehog, particularmente en las regiones de las extremidades y del sistema nervioso. Los brotes de las extremidades se observaron en preparaciones completas con mayor aumento para evaluar el patrón general. Asimismo, seccionaron porciones diseccionadas con un microtomo vibrante.

La flecha indica una tinción aumentada en la punta distal nula de sonic hedgehog en secciones obtenidas con un criostato. La tinción mediante túnel se utilizó junto con OT Tracker en estos cortes; aunque no existe una correlación estricta uno a uno entre el marcador lyo y la tinción mediante túnel, las regiones generales de muerte celular programada (PCD) coinciden considerablemente bajo mayor aumento. Es posible observar perforaciones que dieron positivo en el ensayo de túnel, pero no en el colorante otra; perforaciones que se tiñen solo con el colorante lyra; y perforaciones que presentan tinción superpuesta. Después de 10 días de cultivo corporal del embrión, las células se diferenciaron en una variedad de tipos celulares, incluyendo neuronas, células musculares y cardiomiocitos.

En el cultivo normal de células ES diferenciadas, hay algunas células que sufrieron PCD, tal como se detectó mediante los ensayos con lyo tracker y tunnel. A continuación, las células fueron tratadas con peróxido de hidrógeno para inducir la muerte celular por estrés oxidativo. Una dosis baja de peróxido de hidrógeno aumentó tanto la tinción con lyo tracker como con tunnel en comparación con la ausencia de tratamiento.

De forma similar a los resultados en el embrión, ambas tinciones marcaron células comunes y únicas. Una dosis elevada de peróxido de hidrógeno provocó la contracción celular y una mayor presencia generalizada de señal positiva para OT tracker y para el ensayo TUNEL. A modo de comparación, se utilizó la privación de suero para inducir autofagia tras una hora de privación de suero.

La tinción del marcador OT aumentó. Sin embargo, la positividad al ensayo TUNEL se mantuvo en niveles normales. Por lo tanto, aunque el reer es sencillo y útil, es importante realizar ensayos adicionales para determinar si la tinción representa apoptosis o autofagia después de cuantificar las muestras.

Utilizando el sencillo método de Photoshop demostrado anteriormente, los resultados confirmaron que concentraciones crecientes de peróxido de hidrógeno provocaron un mayor nivel de tinción con Lys Tracker. Una vez dominado, este procedimiento de tinción puede realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente siguiendo este protocolo. Otros métodos, como la inmunotinción con NX en cinco o LC tres, pueden realizarse para confirmar el tipo de muerte celular. No olvide que actualmente Trecker Green solo funciona en células vivas, por lo que Reca Red es su mejor opción para muestras que requieren fijación.