Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Este experimento describe cómo obtener cristales de calidad para difracción de una proteína unida al ADN que contiene una metilación hemi en tándem en GATC. Repetir para favorecer el empaquetamiento cristalino del complejo proteína-ADN. Comience con el diseño racional de la longitud del ADN, el espaciado de GATC y los extremos del ADN; luego proceda con los oligonucleótidos monocatenarios complementarios para purificar el ADN y posteriormente anelarlos para formar el dúplex de ADN hemimetilado, seguido de la mezcla con SeqA purificada para formar el complejo.

A continuación, determine las condiciones óptimas para cultivar cristales de calidad para difracción del complejo proteína-ADN mediante ensayos de cristalización utilizando cribados comerciales de matriz dispersa. Resultados demostrados. Comparta el efecto de la variación en la longitud del ADN, el espaciado GATC y los extremos sobre la calidad de difracción de los cristales de ADN CQ A.

El objetivo de este trabajo es obtener cristales de calidad para difracción de CK unido al ADN, pero también puede ayudar a comprender las variables generales que deben considerarse al diseñar dúplex de ADN para la cristalización de otros complejos proteína-ADN. El procedimiento descrito se utilizará en Chang, A, becaria doctoral de mi laboratorio. Este estudio emplea una variante de las proteínas reguladoras de la replicación del ADN, una proteína SeekA que forma dímeros estables y presenta una región de unión acortada entre sus dominios de dimerización y de unión al ADN.

Esta variante restringe la unión al ADN a repeticiones tandem de GATC separadas exclusivamente por una vuelta en el ADN. En primer lugar, transforme células BBL 20 1D con el plásmido que codifica DEMETRIC seq A bajo el control del promotor T7. Incubar la reacción de transformación en placas de agar LB que contienen 100 microgramos por mililitro de ampicilina y colocar en el incubador bacteriano durante la noche. Seleccione colonias mixtas e inicie un cultivo nocturno a pequeña escala.

Al día siguiente, inocule un cultivo de un litro con 10 mililitros del inóculo preparado durante la noche. Cuando el cultivo esté en fase logarítmica, agregue dos mililitros de IPTG 0,5 molar para inducir la producción de proteína. Continúe la incubación durante tres horas en un agitador orbital a 37 grados Celsius.

Luego, recoger las células por centrifugación a 3.300 ×g durante 10 minutos. A continuación, suspender la pasta celular en tampón de purificación mediante sonicación y clarificar el lisado por centrifugación a 39.000 ×g durante 40 minutos. Ahora, cargar el sobrenadante S en una columna de heparina equilibrada con tampón de purificación.

Para eluir la proteína CK, utilice un gradiente lineal hasta un cloruro de sodio de un molar; la proteína CK se eluye alrededor de 0,7 molar de cloruro de sodio. Recopile las fracciones que contienen CK y dilúyalas para reducir la fuerza iónica de la muestra.

Luego, cargue la muestra en una columna de cromatografía de intercambio catiónico E equilibrada con tampón de purificación. Aplique un gradiente lineal de sal para eluir la proteína CK pura a aproximadamente 0,4 M de cloruro de sodio. Combine las fracciones que contienen CK.

Concentre hasta tres miligramos por mililitro y almacene en condiciones de almacenamiento. Diseñe un tampón complementario para oligonucleótidos no metilados y metilados. Prepare muestras de un micromol de cada cadena sencilla de ADN liofilizada en 800 microlitros de agua doblemente destilada y autoclavada, vortexee y deje reposar durante 15 minutos ahora y 800 microlitros.

Ha precalentado dos veces el tampón de carga a cada muestra para preparar un gel desnaturalizante grande al 10% para oligonucleótidos de 20 a 30 nucleótidos de longitud. Una vez polimerizado, retire el peine y enjuague cuidadosamente el pozo. Monte el gel llenando los depósitos superior e inferior con tampón de electroforesis TBE una vez.

Preparar el gel a 750 voltios para calentar el gel hasta 55 grados Celsius. Luego detener la corrida y enjuagar cuidadosamente los pozos con tampón en circulación. Ahora calentar los oligonucleótidos a 90 grados Celsius durante dos minutos.

Vortexee y centrifugue. Proceda inmediatamente a cargar las muestras en el gel. Corra el gel a aproximadamente 700 voltios hasta que el oligonucleótido haya migrado.

A la mitad, en un gel de poliacrilamida al 10 %, el azul de fenol alfa co-migra con oligonucleótidos de aproximadamente 20 bases de longitud y el xileno cianino con unos 60 bases de longitud. Desarme el gel del aparato y retire los espaciadores sobre una superficie plana. Retire una placa de vidrio y cubra el gel con papel de plástico.

Luego, invierta el gel, retire la otra placa de vidrio y cubra el gel con una envoltura de plástico. A continuación, marque las bandas utilizando luz ultravioleta y una placa fluorescente detrás del gel. Para ver la sombra del ADN con una cuchilla de afeitar, excise la banda y córtela en trozos pequeños.

Transfiera cada muestra a un tubo estéril de 15 mililitros. Añada nueve mililitros de tampón eluyente y diluya durante la noche a 37 grados Celsius con agitación. Transfiera cuidadosamente la solución a un tubo de centrífuga para autoclave utilizando una punta de pipeta para carga de geles.

Para evitar la transferencia de fragmentos de acrilamida, agregue un mililitro de acetato de sodio tres milimolar a pH 7 más 25 mililitros de etanol al 100 % enfriado, incube a menos 20 grados Celsius durante al menos tres horas. Centrifugue el ADN precipitado. Luego seque los pellet en el speed vac a temperatura media, resuspenda cada pellet en 400 microlitros de agua doblemente destilada y esterilizada en autoclave y transfiera a un tubo nuevo.

Añada 40 microlitros de acetato de sodio tres molar a pH siete y un mililitro de etanol al 100 %; mezcle mediante vortex e incube durante 30 minutos a menos 20 grados Celsius. Tras centrifugar durante 15 minutos a 18.000 veces G, lave los pellet de ADN con 100 microlitros de etanol frío al 70 % para eliminar cualquier sal residual; centrifugue durante seis minutos a 18.000 veces G, luego deseche el etanol y seque el pellet en un evaporador rápido.

Ahora, resuspenda cada precipitado en 100 microlitros de agua doblemente destilada autoclaveada. Determine la concentración de los oligonucleótidos mediante espectrometría. Para preparar los dúplex de ADN hemimetilados, primero mezcle concentraciones molares iguales de las cadenas simples complementarias.

Luego, caliente las mezclas a 95 grados Celsius en un baño de agua durante cinco minutos para desnaturalizar las cadenas. Deje que las muestras se enfríen lentamente hasta la temperatura ambiente dentro del baño de agua. Combine volúmenes iguales de proteína CQ purificada a 81 micromolar y ADN hemimetilado a 81 micromolar.

Luego, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Almacenar a cuatro grados Celsius hasta su uso. Evaluar las condiciones de cristalización utilizando cribados comerciales de matriz dispersa. Una vez identados los primeros indicios de cristalización, optimizar las condiciones para obtener cristales de calidad para difracción. Crioprotectar los cristales resultantes de ADN de CK.

O bien aumente la cantidad de PEG 400 presente en la solución de cristalización hasta una concentración final de 25 %, o agregue 20 % de glicerol a la solución de cristalización. Extraiga cristales individuales con un lazo de nailon mediante congelación rápida. Congele las muestras en nitrógeno líquido.

Ahora pruebe el límite de difracción de cada cristal a 100 K. Para obtener la estructura cristalina del mutante acortado de CK unido al ADN hemimetilado, optimizamos consecutivamente tres parámetros en el ADN: el espaciado entre las secuencias GATC hemimetiladas, la longitud del dúplex y la ausencia o presencia de extremos salientes en el extremo cinco prima. Este estudio utiliza una variante DME de seek a con una mutación puntual en el dominio terminal que evita una ligamentización adicional y un conector acortado que restringe la unión al ADN en tándem.

Los ensayos de retardo electroforético en ADN indican que las repeticiones GATC separadas exclusivamente por una vuelta se unen preferentemente a la proteína CK modificada cuando están separadas por nueve a diez pares de bases. Por lo tanto, las pantallas iniciales utilizan dúplex de 23 a 24 pares de bases de longitud que contienen dos repeticiones GATC hemimetiladas separadas por nueve o diez pares de bases.

Tres dúplex produjeron cristales de forma bien definida. Aunque ninguno de los cristales difractó hasta una resolución alta, los datos indicaron que la separación A-G-A-T-C de nueve pares de bases era preferida para la cristalización. Incluir un dinucleótido CG entre los dos sitios GATC aumentó inesperadamente las interacciones del surco con el esqueleto, sin alterar el límite de difracción de los cristales.

Por el contrario, optimizar la longitud de los extremos salientes cambió drásticamente los contactos moleculares y la morfología del cristal. La estructura cristalina de esta proteína CK unida a un dúplex de ADN hemimetilado confirmó que la cara libre del dúplex de ADN no participa en contactos cristalinos a pesar del tamaño relativo de la proteína y el ADN; la mayoría de las interacciones entre moléculas simétricas están mediadas por proteína, y por interacciones entre proteína y ADN. Curiosamente, en este caso particular, el efecto beneficioso de un extremo saliente dinucleotídico en el extremo cinco prima no se debe a la formación de un ADN pseudocontinuo.

En cambio, el extremo cinco prima de la hebra metilada se proyecta lejos del eje del ADN e interactúa con la molécula de CK adyacente del complejo, lo que explica por qué se requerían estrictamente dos nucleótidos para cambiar el empaquetamiento cristalino. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar proteínas y diseñar dúplex de ADN para la cristalización de complejos proteína-ADN. Es importante recordar que, aunque este protocolo fue diseñado para cristalizar el complejo CK-ADN, la optimización racional de la longitud, la secuencia y los extremos del ADN proporciona un marco general para el diseño de dúplex de ADN destinados a la cristalización de otros complejos proteína-ADN.