Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

El objetivo general del siguiente experimento consiste en diferenciar células madre pluripotentes humanas, o H PSCs, en neuronas utilizando un formato de placa de múltiples pocillos. Esto se logra recolectando e inocular una suspensión de células individuales de H PSCs en placas de fondo en V de 96 pocillos para formar cuerpos embriónicos, o EBS, durante la noche.

A continuación, los EBS se transfieren a placas ultrabajas en forma de U sin adhesión que contienen medio de diferenciación para inducir la formación de neuroectodermo. Posteriormente, los EBS se siembran en placas recubiertas con matrigel para favorecer la proliferación de neuronas. Los resultados pueden obtenerse alrededor del día ocho, mostrando la presencia de marcadores neuronales típicos mediante inmunofluorescencia.

Los protocolos de tinción para diferenciar células madre pluripotentes humanas en neuronas suelen ser complicados y tediosos. De manera algo accidental, descubrimos un procedimiento muy sencillo para obtener neuronas a partir de células madre pluripotentes humanas.

Desde un punto de vista técnico, la principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es fácil de realizar, rápida y rentable. Al mismo tiempo, el procedimiento lo presentará la Dra. MI Z del laboratorio. Prepare el medio de formación de cuerpos embrioides y el medio de diferenciación según se describe en el protocolo escrito.

Cultive las hPSC en condiciones libres de alimentadores, como un medio enriquecido con metilo en placas recubiertas con Matrigel, o utilizando sistemas de cultivo químicamente definidos, bajo condiciones de crecimiento activo y subconfluente. Con un microscopio estereoscópico y una punta de pipeta de plástico estéril, retire mecánicamente las colonias que se han diferenciado espontáneamente. Lave las colonias indiferenciadas restantes con PBS y use Accutase que contenga un inhibidor de rock al 1x para digerirlas hasta obtener células individuales.

Centrifugar las células individuales a 200 G durante dos minutos y resuspender en un pequeño volumen de medio de formación de EB. Utilizar un hemocitómetro para determinar la titulación celular. Añadir células adicionales al medio restante de formación de EB para alcanzar una titulación entre 40.000 y 80.000 células por mililitro.

Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros por pocillo a una placa de fondo V de 96 pocillos, obteniendo entre 4.000 y 8.000 células por pocillo. Centrifugue la placa en una centrífuga con rotor oscilante a 400 ×g durante un minuto para recoger todas las células en el fondo de los pocillos. Transfiera las células a un incubador y permita la formación de EBS durante la noche; al día siguiente, observe bajo el microscopio estereoscópico.

Recoger el EBS y transferirlo en un pequeño volumen a una placa bacteriana de 3,5 centímetros que contenga dos mililitros de medio de diferenciación. Lavar las células rotando suavemente la placa. Añadir 100 microlitros de medio de diferenciación a cada pocillo de una placa de adherencia ultrabaja.

Placa de fondo de 96 pocillos bajo un microscopio estereoscópico. Transfiera EBS en pequeños volúmenes desde el recipiente de lavado a los pocillos U de 96. Incube los EBS durante cuatro días para permitir la formación de neuroectodermo al cuarto día.

Lave las células con medio de diferenciación y siembre una por una en los pocillos de una placa multi-pocillo recubierta con matrigel, como una placa de 12 pocillos. Las células deben distribuirse de manera uniforme dentro de los pocillos para permitir un crecimiento neuronal ininterrumpido. Deje que los EBS se adhieran ligeramente al matrigel durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego, transfiera cuidadosamente la placa al incubador. Las neuronas crecerán desde los EBS sembrados de forma radial durante los próximos cuatro días. Anteriormente demostramos que, en concordancia con muchos otros estudios, los EBS a partir de CPEH podrían generarse simplemente mediante el resembrado de agregados durante la división rutinaria de los CPEH en placas de baja adhesión.

Esto generalmente resulta en una amplia distribución de tamaños celulares. Otro problema es que los EBS mantenidos en suspensión tienden a agregarse entre sí, lo que provoca una heterogeneidad de tamaño aún mayor. Para evitar esto, se sembraron H-PSC individuales en pozos de baja adhesión, lo que resultó en ausencia de formación de EBS y muerte celular. Sin embargo, la combinación de la molécula promotora de la supervivencia celular, Y 2 7 6 3 2, con alcohol polivinílico, que se ha demostrado que mejora la formación de EBS a partir de HSC, permitió la formación de EBS a partir de suspensiones de células individuales de HESC durante la noche.

Convenientemente, los tamaños de los cuerpos embrioides (EB) en este formato de placa de múltiples concentraciones podían controlarse estrechamente ajustando el número de células por pocillo. A diferencia de las técnicas convencionales, tras transferir los EB a placas 96 U con adherencia ultrabaja, la formación de neuroectodermo se indujo mediante un cóctel de moléculas pequeñas compuesto por inhibidores de F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA dos y BP SMA uno, lo que permitió posteriormente sembrar las células sobre matrigel para generar neuronas. Iniciar la formación de EB a partir de aproximadamente 8.000 células produjo la mejor capacidad de diferenciación neuronal, caracterizada por pronunciadas prolongaciones neuronales que emergen de los EB sembrados.

Centros de EB necróticos reducidos tras el siembra y alta expresión de marcadores sensoriales y pan-neuronales como B rrn tres A y beta tres tubulina. Las eficiencias generales de diferenciación neuronal parecen ser comparables al procedimiento original, que hasta ahora es aplicable tanto a CSH como a CIPSH. Tres líneas independientes de CIPSH, así como células HES y CIPSH, se han probado con éxito en el procedimiento de pocillos múltiples, aunque en general no puede descartarse la variabilidad dependiente de la línea celular ni las eficiencias de diferenciación.

Esta figura muestra células neuroectodérmicas disociadas del día cuatro, sembradas como células individuales y diferenciadas con éxito con una eficiencia de aproximadamente el 60 %. Manejar EBS en la plataforma de múltiples pocillos requiere un poco de entrenamiento al principio, pero después de cierto tiempo verá que es bastante sencillo.