Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

La regulación de la señalización del complejo eIF4F se asocia con una mayor traducción del subconjunto de ARNm que está involucrado en la proliferación y supervivencia del cáncer. Aquí describimos un ensayo de interacción proteína-proteína basado en células eIF4E-eIF4G que nos permite evaluar la perturbación inducida por fármacos en la integridad del complejo eIF4F en células vivas. Existe un interés creciente en el desarrollo de modalidades que se dirijan de manera eficiente a la interfaz proteína-proteína.

Imaginamos que nuestros ensayos PPI eIF4E-eIF4G ayudarían a fomentar estas estrategias y validarlas. Este ensayo proporcionará un esquema primario óptimo para liderar la optimización de los inhibidores de eIF4E-eIF4G. La siembra correcta de la célula y la realización de la transfección de transferencia son los aspectos más desafiantes de este producto, ya que pueden reflejarse directamente en la supresión del sistema de informes de PPI.

Después de descongelar y contar las células, siembre placas de 6 pocillos con células HEK 293, utilizando 2 mililitros de medio de crecimiento estándar por pocillo. En la mañana del día 2, para cada transfección planificada, diluir 9 microlitros de solución a base de liposomas en un tubo que contenga 125 microlitros de medio sérico reducido sin rojo de fenol. Mientras los liposomas diluidos se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos, prepare la mezcla maestra de ADN diluyendo 3 microgramos de cada plásmido en 125 microlitros de medio sérico reducido para cada tubo de transfección.

Agregue 12 microlitros de reactivos potenciadores a la mezcla maestra de ADN 2, luego mezcle bien. Agregue inmediatamente esta mezcla a cada tubo de liposomas diluidos en una proporción de 1 a 1. Después de incubar este complejo lipídico de ADN durante 15 minutos a temperatura ambiente, agregue el complejo a cada pocillo de las 6 placas de pocillos.

Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. En la mañana del día 3, enjuague cada pocillo con 1 mililitro de PBS y agregue 0,3 mililitros de tripsina. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 5 minutos.

Después de la incubación, neutralice la tripsina agregando 2 mililitros a cada pocillo del medio sérico reducido sin rojo fenol. Transfiera las células transfectadas a un tubo de 15 mililitros. A continuación, centrifuga las células a 290x G durante 5 minutos.

Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet celular en 2 mililitros del medio sérico reducido. Siembre las células HEK 293 transfectadas en placas opacas de 96 pocillos, a una densidad de 30.000 células por pocillo en 90 microlitros de medio. Para obtener 3 réplicas técnicas de 3 compuestos diferentes dentro de un mismo experimento, se siembran 60 pocillos.

Excluya los pozos en los bordes. Inmediatamente después de sembrar las células transfectadas, agregue 10 microlitros de solución compuesta al 10% de DMSO a cada pocillo. Prepare soluciones madre compuestas de 1 milimolar disolviendo cada compuesto de interés en 100% DMSO.

Para obtener 3 réplicas para cada valoración de compuesto, utilice 8 microlitros de la solución madre compuesta de 1 milimolar. Realice una dilución en serie doble de cada solución compuesta madre en 8 pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos pipeteando 4 microlitros del material de 1 milimolar en 4 microlitros de DMSO al 100 % para cada punto de valoración. Deseche los 4 microlitros adicionales después del último punto de la dilución en serie doble.

Agregue 36 microlitros de agua estéril de grado HPLC a cada tubo para preparar 40 microlitros de soluciones de dilución en serie compuestas 10x en DMSO al 10%. Además, prepare un control. 10%DMS solo solución madre en agua estéril de grado HPLC.

Agregue 10 microlitros de soluciones de trabajo 10x a las celdas en la placa opaca de 96 pocillos para obtener la concentración final prevista, con una concentración residual de DMSO del 1%Incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Después de 3 horas, comience a preparar el reactivo de sustrato de luciferasa combinando 1 volumen de sustrato con 19 volúmenes del reactivo de dilución. Utilice una pipeta multicanal para añadir inmediatamente 25 microlitros del reactivo de sustrato a cada pocillo de la placa de 96 pocillos con las células.

Agite la placa en un agitador orbital a 350 RPM, durante 50 minutos a temperatura ambiente. Para evaluar la luminiscencia, coloque la placa en un lector de placas. Ajuste el lector de espejos a luminiscencia y el filtro de emisión a 455.

Utilice una altura de medición de 6,5 milímetros con un tiempo de medición de 1 segundo. Para evaluar la viabilidad celular, agregue 33 microlitros de reactivo de ensayo de viabilidad a cada pocillo. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, evalúe la luminiscencia con el lector de placas ajustando el lector de espejo a luminiscencia y el filtro de emisión a 600.

Utilice una altura de medición de 6,5 milímetros y un tiempo de medición de 1 segundo. Utilice los datos del lector de placas para determinar el valor IC 50 de cada compuesto, ajustando los datos a la ecuación de curva de ajuste de 4 parámetros descrita en el manuscrito. Las células HEK 293 se transfectaron con el sistema de complementación eIF4E-eIF4G, y luego se retiraron y trataron con inhibidores de mTOR.

Cuando se evaluó la luminiscencia 4 horas después del tratamiento, PP242 y rapamicina produjeron una inhibición de la señal dependiente de la dosis. Ni PP242 ni rapamicina produjeron una disminución significativa en la viabilidad celular, lo que indica que la disminución de la luminiscencia en el sistema de complementación eIF4E-eIF4G no se debe a la muerte celular inespecífica, sino más bien a la interrupción de la interacción EIF4E-4G. El análisis de Western blot, siguiendo el experimento de reducción de m7GTP, mostró que la interrupción mediada por 4EBP1 de la interacción endógena eIF4E-eIF4G se correlaciona con la señal de ensayo eIF4E-eIF4G medida.

PP242 fue un inhibidor más potente de la fosforilación total de 4EBP1 que la rapamicina. Ambos inhibidores mostraron un impacto en la señalización de mTOR normalmente, siendo la rapamicina más activa contra los sustratos de mTORC1 y PP242 dirigiéndose tanto a mTORC1 como a mTORC2. El aspecto más crítico de este producto es la siembra de las células el día de la transacción, la resiembra de las células en un medio sin rojo fenol, la evaluación de la luminiscencia del ensayo de complementación eIF4E-eIF4G y la ejecución del ensayo de viabilidad en la misma placa.

Se puede realizar un ensayo de viabilidad secundario para evaluar cualquier fármaco de efectos específicos conocidos y objetivo.