La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica

Hola, soy Kevin Won. Soy estudiante de maestría en ingeniería en el Laboratorio de Biofluidos de la Universidad de Cornell. Y hoy voy a hablar sobre el uso de un dispositivo microfluídico basado en agarosa para estudiar el efecto del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células madre neurales de ratón.

El dispositivo consiste básicamente en tres canales microfluídicos, cada uno de 150 micrones de ancho. El EGF se bombea hacia uno de los canales laterales y el tampón se bombea hacia el otro canal lateral. Básicamente, establece un gradiente químico lineal estático a través del canal central.

Dado que el EGF se difunde fácilmente a través del gel de agarosa, las células madre neuronales se siembran en el canal central y se monitorea el progreso de su migración mediante un microscopio. Así, los dispositivos consisten básicamente en una capa superior de plexiglás que tiene todas las entradas y salidas para conectar los tubos. Y debajo de esta se encuentra una membrana de gel de agarosa, que contiene cuatro dispositivos con patrón.

Esto está rodeado por un espaciador de PDMS, que garantiza un espesor constante en todo el dispositivo. El PDMS y el gel se ensamblan sobre un portaobjetos de vidrio, que está recubierto con ect. Esto ayuda a que las células se adhieran al portaobjetos de vidrio.

Además, la placa de acero inoxidable se utiliza para montar todo el dispositivo, y nosotros ensamblamos el dispositivo como un sándwich mediante tornillos. La línea celular de tipo salvaje ha sido transfectada con un vector de retrovirus para sobreexpresar el receptor de EGF de tipo salvaje, y la línea celular delta ha sido transfectada con una versión mutada del receptor de EGF que le permite estar constitutivamente activo sin el ligando EGF. Bien, entonces comenzaré explicando el proceso de ensamblaje de nuestro dispositivo microfluídico.

Entonces, primero coloqué el espaciador de PDMS alrededor de las características en relieve de los microcanales de silicio en nuestros moldes. Ahora voy a pesar 0,3 gramos de agros. Ahora voy a preparar 10 mililitros de medio independiente de CO₂ y añadirlos al agros.

Y voy a pipetear arriba y abajo para mezclar el polvo de agros con el medio independiente de CO2. Ahora estamos listos para el microondas. Como pueden ver, el agros ya está licuado, pero aún quedan algunas partículas granulares.

Intentaré girarlo para disolver el gránulo y eliminar las burbujas de aire. Así que estoy vertiendo el agar fundido sobre las características en relieve del molde maestro de silicio y ahora tomaré una portaobjetos de vidrio estéril y la colocaré sobre el espaciador de PDMS. Y la coloco en un ángulo para intentar expulsar la mayor parte de las burbujas de aire del gel de agar.

Y apliqué presión y continuaré aplicando presión hasta que la cáscara de agros se solidifique. Después de uno a dos minutos, se ha solidificado. Ahora eliminaré el exceso de agros del portaobjetos.

El siguiente paso consiste en deslizar suavemente la cubeta y esta puede ser descartada. Ahora voy a intentar transferir suavemente el patrón de agros a una cubeta que previamente he recubierto con fibronectina. Básicamente, uso esta lámina estéril de plástico para ayudarme a levantar el patrón de agros con el espaciador de PDMM MS y transferiré el patrón de agros con los canales hacia abajo, en dirección a la cubeta.

Ahora que esto está firmemente sobre el portaobjetos de vidrio, haré perforaciones en los reservorios individuales para que el manifold de plástico tenga acceso a los canales. Haré esto utilizando un perforador metálico pequeño. Ahora hemos terminado de hacer las perforaciones en el dispositivo.

Añadiré 500 microlitros de medio independiente de CO2 para evitar la desecación de los microcanales y ahora lo dejaré reposar durante uno o dos minutos. Bien, después de uno o dos minutos, intentaré drenar el exceso de medio y ahora alinearé los orificios perforados en el patrón de agros con los orificios de entrada y salida del manifold de plexiglás. Y una vez que los orificios estén alineados, presionaré firmemente para formar un buen sello.

Ahora coloco el manifold de plexiglás sobre los soportes de acero inoxidable y ahora voy a ensamblar suavemente el dispositivo utilizando tornillos. Tengo mucho cuidado de no apretar en exceso los tornillos porque esto comprimiría los canales, y coloco los tornillos en sentido horario para evitar que el gel de Agros en el interior se desplace fuera del patrón. Voy a aspirar un mililitro de medio y usaré esta jeringa para probar el dispositivo.

Y como puede observarse, estoy inyectando fluido en cada microcanal y verificando que salga fluido por cada salida. En este momento he colocado el dispositivo ensamblado dentro de la cámara ambiental del microscopio. Esta se mantiene a 37 grados Celsius, por lo que calentará el dispositivo y lo preparará para cuando necesitemos sembrar las células.

Y como puede ver, ya he pasado los dos tubos de la bomba parasol a través del montaje. Actualmente estoy lavando los tubos con PBS en preparación para nuestros experimentos. Ahora vamos a configurar los tubos.

Voy a pasar la tubería de la bomba de parasol a través de las tapas con orificios ya perforados. Cada tubería tiene un número específico de muescas para que pueda identificar tanto la entrada como la salida de la tubería. Por lo tanto, la tubería con cuatro muescas recibirá 10 nanogramos por mililitro.

La solución de EGF se conectará ahora al dispositivo mediante el tubo. Así que la conectaré a cada dispositivo según la cantidad de muescas que tenga, de modo que corresponda a la solución que está tomando.

Ahora conecto el tubo de salida. Utilizamos un tubo tigón transparente para asegurarnos de que el medio fluye efectivamente a través del tubo de salida y de que no hay obstrucciones en el canal. Ahora iniciaré las bombas parasol.

Ahora comenzaré el procedimiento para sembrar las células en el canal central. Comenzaré retirando el medio en exceso del canal del sensor. Ahora observaré las células.

Las células ya están en suspensión en medio independiente de CO₂. Y yo sembré, sembré 60 en la entrada del canal central y sembré 20 microlitros en la salida. Y se espera que las células se asienten por flujo impulsado por la gravedad.

Y repetiré este procedimiento para los otros dos canales sensibles y ahora observaremos esto bajo el microscopio para verificar si la adhesión celular fue exitosa. En este momento, las células ya se han adherido al portaobjetos de vidrio y, en unos minutos, comenzarán a extenderse y adoptarán su morfología característica. Hoy hemos cubierto el ensamblaje del dispositivo real, la preparación de los reactivos y las técnicas microscópicas que utilizo para obtener imágenes de la migración celular dentro del dispositivo.

En conclusión, esperamos que este dispositivo tenga una aplicación mucho más amplia, específicamente en el entorno clínico. Así que la figura uno en forma horizontal. Muestra las trayectorias de las células C 17.2 y concentraciones crecientes de EGF en forma vertical.

Muestra las trayectorias de las distintas cepas de células C 17.2 que hemos utilizado en nuestros experimentos con la misma concentración de EGF. Los datos de las células parentales muestran un pico en la motilidad a un gradiente de concentración de EGF de 10 nanogramos por mililitro, lo que indica que los receptores se han saturado con el ligando a una concentración más alta de EGF. Y los datos del tipo silvestre muestran un aumento en la motilidad a la concentración de cien nanogramos por mililitro de EGF.

Esto indica que los receptores no se saturan a concentraciones más altas de EGF. Esto tiene sentido, ya que han sido diseñados para sobreexpresar el receptor de EGF. Finalmente, los datos de la línea celular delta indican que la motilidad de las células es aproximadamente independiente de la concentración de EGF.

Esto también era esperado, ya que los receptores de EGF mutados fueron diseñados para activarse independientemente de la presencia de EGF.