Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Las pipetas capilares de vidrio se han vuelto omnipresentes en los laboratorios para una amplia variedad de técnicas, como la electroforesis en una sola célula, la microinyección de ADN y la electrofisiología con parche. Para preparar electrodos de vidrio capilar para grabaciones con parche, se tira del vidrio de silicato en un aparato polar programable. Las puntas de los electrodos se recubren con cera, luego se pulen con llama y se almacenan para su uso futuro. Hola, soy Miriam Goodman del Departamento de Fisiología Molecular y Celular de la Universidad de Stanford.

En este video, demostraré cómo fabricar pipetas para el registro de parches y electrodos afilados para la electrofisiología. Los microelectrodos de vidrio, también llamados pipetas, han sido una herramienta fundamental de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, estas pipetas se fabrican a partir de capilares de vidrio utilizando un tirador programable.

Así que comencemos. Para fabricar pipetas para el registro de parche, utilizamos capilares de vidrio borosilicato Sutter libres de polvo y limpios, y empleamos el micropipeteador con filamento calefactor Sutter P-97. El Manual de Pipetas de Sutter es una excelente referencia para desarrollar programas adecuados de tracción.

Para comenzar, levante la cubierta protectora del extractor. Luego tome un tubo capilar de vidrio de la caja. Asegúrese de reemplazar la tapa para minimizar la acumulación de polvo.

A continuación, con una mano, deslice el capilar hacia la ranura en un lado del filamento y apriete ligeramente la pinza. En este momento, la pinza debe estar lo suficientemente apretada como para evitar que el tubo se caiga, pero lo suficientemente suelta como para poder deslizarlo dentro de la ranura. Ahora, suelte el tope de metal con resorte en el mismo lado.

Luego, con el pulgar y el índice, sujete las lengüetas metálicas que están unidas a la parte inferior de ambos portadores. Suelte el otro tope metálico de resorte. Junte los portadores todo lo que puedan y manténgalos en su lugar con una mano.

A continuación, deslice el tubo a través del alojamiento del filamento hasta el surco del portador en el otro lado. Evite empujar el vidrio hacia el filamento calefactor. Apriete las abrazaderas en ambos lados.

Deben quedar lo suficientemente ajustados para mantener los portadores en su lugar, pero no tan apretados que se rompa el vidrio. Ahora, cierre la tapa contra el polvo y presione el botón verde. Los micropipetas con punta afilada para grabaciones de parche se forman utilizando un programa de cinco pasos de tirado con calor y velocidad descendentes en cada paso y una pequeña punta en el último paso.

Este programa utiliza calor y gravedad. El procedimiento para fabricar electrodos afilados es muy similar, pero en este caso utilizamos el capilar de vidrio delgado de Warner Instruments que tiene un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,78 milímetros. También aplicamos un programa de tracción que emplea un motor además de calor y gravedad cuando finalizan los programas de tracción.

Levante la cubierta protectora, afloje ambas abrazaderas y retire la pipeta terminada. Luego coloque las pipetas en una caja de trabajo. La caja puede fabricarse pegando una tira de espuma al soporte de una caja de puntas de pipeta de plástico y luego cortando de seis a ocho ranuras en la espuma.

Inserte las pipetas en las ranuras. Una vez que la caja esté llena de pipetas estiradas, proceda al paso de pulido con llama para pulir las pipetas con fuego. Configure un equipo de microhorno con un filamento de platino para calentar, controlado por un pedal, antes de comenzar el pulido con llama.

Primero, recubra la pipeta con cera dental para reducir la capacitancia y mejorar las características de ruido. Para hacer esto, mantenga una pequeña cantidad de cera fundida cerca. Aplique presión de aire en la parte posterior de la pipeta para evitar que la cera entre en la punta.

Luego sumerja brevemente la punta en la cera líquida. Y retírela ahora. Coloque la pipeta en el aparato de pulido y acerque la punta aproximadamente a 50 micrones del filamento.

Tenga en cuenta que el filamento se expandirá al calentarse. Aplique un breve pulso de calor de uno o dos segundos para eliminar la cera de la punta de la pipeta y suavizar el vidrio. Examine las puntas de la pipeta bajo un microscopio para determinar el diámetro de la abertura y la suavidad.

Para grabaciones estándar de bloqueo de parche, las aberturas de las puntas deben tener de uno a tres micrones de diámetro; deseche las puntas defectuosas, ásperas, irregulares o desiguales. Coloque la micropipeta terminada en una caja de trabajo, asegurándose de cerrar la tapa para proteger las micropipetas del polvo. Repita el procedimiento para 10 micropipetas exitosas. Acabo de mostrarle cómo fabricar micropipetas para bloqueo de parche y electrodos afilados utilizando un extractor programable.

El mismo procedimiento puede utilizarse para fabricar una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección para obtener resultados óptimos en el registro de parche. Es importante recordar extraer nuevas pipetas libres de polvo el mismo día del experimento y pulirlas dentro de la hora previa al experimento. Asimismo, verifique mediante inspección que las pipetas estén lisas y pulidas.

Asegúrese de ver nuestro otro video, que demuestra cómo realizar el registro de parche de canales iónicos expresados en ovocitos de opus. Bien, eso es todo. Ahora usted es un experto en pipeteo y buena suerte con sus experimentos.