Antifouling monocouches auto-assemblées sur les microélectrodes pour des biomolécules Modélisation

Cette procédure commence par la fabrication d'une microélectrode sur un substrat en silicone. Une monocouche auto-assemblée de polyéthylène glycol est formée sur la microélectrode et le substrat afin d'éviter l'encrassement par les microtubules. Ensuite, des microtubules marqués à la rhumine sont préparés.

Enfin, les microtubules sont disposés sur les électrodes traitées par électrophorèse. Bonjour, je suis John Noel du laboratoire Nana du Département de physique et du Laboratoire de biomécanique moléculaire du Département de génie biomédical de l'Université Texas A&M. Je suis Wil free Teza du département de physique et directeur du Centre de compétences en science et technologie de l'Université Texas A&M.

Et je suis Juan Quang, directeur du laboratoire de biomécanique moléculaire au département de génie biomédical de l'Université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de fabrication d'électrodes microscopiques recouvertes d'une monocouche auto-assemblée résistante à l'encrassement. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le palissage de microtubes par électrophorèse.

Commençons. Pour commencer, utilisez un stylet ou un coupe-wafer pour découper des tranches de silicium en morceaux de un centimètre sur 1,5 centimètre afin de les utiliser comme substrats. Nettoyez maintenant les substrats en les plaçant dans un bécher contenant suffisamment d'acétone pour les recouvrir, puis soumettez-les à une sonication pendant cinq minutes sans laisser les substrats sécher.

Les rincer à l'acétone fraîche, puis immédiatement à nouveau à l'isopropanol, et les sécher à l'aide d'azote. À l'aide d'une lithographie optique en ton positif standard ou d'une lithographie par faisceau d'électrons, fabriquer les microélectrodes en or sur les substrats propres. Lors de la conception de la géométrie du motif, maintenir le diamètre de chaque motif d'électrode en dessous de 100 microns. Afin d'assurer la couverture par la monocouche auto-assemblée de triméthoxy silane de polyéthylène glycol ou SAM PEG, inclure des plots de contact positionnés à 300 à 500 micromètres du motif, reliés à l'électrode par une ligne d'un millimètre.

Après le développement du motif dans la couche de résine, utilisez des pinces pour griffer une ligne dans la résine depuis le plot de contact jusqu'au bord du substrat. Lors du dépôt du métal, la rayure permettra un contact électrique entre l'électrode et le bord du substrat. Une chambre de dépôt, de préférence équipée de deux sources, est utilisée pour déposer la couche métallique.

Les électrodes sont formées par dépôt de deux nanomètres de chrome, suivis de six nanomètres d'or. Sans rompre le vide, un microbalance à cristal de quartz équipée à l'intérieur de la chambre peut être utilisée pour mesurer l'épaisseur des films pendant le dépôt. Nous pouvons maintenant commencer à préparer la monocouche auto-assemblée dans un endroit bien ventilé, préchauffer un four à 75 degrés Celsius. Préparez la solution d'immersion en ajoutant un millilitre de pégsélène à 20 millilitres de toluène dans un bécher en verre de 250 millilitres.

Mélanger soigneusement en aspirant et en expulsant cinq à dix fois à l’aide d’une pipette, puis agiter avec la pipette pendant 30 secondes. Placer les échantillons de motif dans le bécher, côté motif vers le haut, en veillant à ce qu’ils soient entièrement immergés dans la solution et régulièrement espacés sur le fond du bécher. Placer le bécher dans l’étuve et faire cuire de 18 à 21 heures pendant la formation du Sam.

Préparez l'électrode de contre-électrode en déposant un nanomètre de chrome suivi de quatre nanomètres d'or sur une lame de verre de 22 par 50 millimètres. L'électrode de contre-électrode doit être presque transparente avec une teinte gris clair ou rose. Conservez l'électrode de contre-électrode, côté recouvert vers le haut, dans une boîte de Pétri afin de la maintenir propre.

Après 18 à 21 heures au four, retirez le bécher du four. Le toluène devrait s'être évaporé, laissant les échantillons de motif dans un résidu visqueux de peg cline. Ajoutez 20 millilitres de toluène dans le bécher et faites tremper les échantillons pendant une à deux minutes.

Retirez les échantillons du bécher et rincez-les avec du toluène, puis de l'isopropanol, et séchez-les enfin à l'azote. À ce stade, les échantillons doivent paraître propres et la couche de Sam doit être invisible à l'œil nu. Les échantillons de Sam préparés de cette manière sont utilisables jusqu'à deux jours s'ils sont conservés dans des conditions fraîches et sèches.

Une formation infructueuse des SAM entraîne un dépôt résiduel trouble ou à teinte irrégulière sur la surface. Une fois les SAM préparés, nous pouvons maintenant commencer la polymérisation de la tubuline en microtubules. Commencez par décongeler la tubuline non marquée et la tubuline marquée au r domine, puis mélangez-les immédiatement selon un rapport de deux pour un, respectivement non marquée par rapport à marquée, afin d'obtenir des microtubules brillants.

Les mélanger soigneusement en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Ensuite, polymériser la tubuline pendant 20 à 40 minutes dans un bain-marie chauffé à 37 degrés Celsius, pendant que la tubuline se polymérise. Préparer un tampon pipes Taxol en mélangeant du Taxol à 20 micromolaire avec du tampon pipee.

Mélanger soigneusement en pipetant plusieurs fois de haut en bas et en vortexant, puis placer le tube dans le bain chauffé à 37 degrés Celsius. Après la polymérisation, diluer les microtubules dans du tampon Taxol tiède et les protéger de la lumière. Vérifier que la polymérisation des microtubules a réussi et que les microtubules sont stables pendant plusieurs minutes d'excitation en fluorescence.

En imagerie des microtubules préparés avec un mélange désactivateur d'oxygène, la polymérisation de la tubuline en microtubules est complète. Commencez le dessin du MTS par électrophorèse. Pour commencer, découpez un morceau de ruban adhésif double face en fines bandes en le plaçant sur une lame de verre et en utilisant une lame de rasoir pour couper. Placez deux bandes de ruban adhésif double face sur l'échantillon recouvert de Sam dessiné, de sorte que l'électrode se trouve entre les bandes, le trajet de connexion étant perpendiculaire au ruban.

Placer l'électrode auxiliaire sur le ruban adhésif double face avec le côté métallique en contact avec le ruban, de sorte que le bord de l'échantillon dépasse d'environ trois millimètres au-delà de l'électrode auxiliaire. Couper plusieurs morceaux de fil magnétique en cuivre isolé d'une longueur de 15 centimètres et dénuder un centimètre d'isolation à chaque extrémité. Utiliser une petite goutte de peinture argentée pour fixer un fil sur la zone dorée exposée du substrat, en prenant soin d'éviter tout contact électrique avec l'électrode auxiliaire.

Utilisez maintenant de la peinture argentée pour fixer un deuxième fil au contre-électrode. Les fils d'électrode fixés avec de la peinture argentée peuvent être davantage sécurisés sur les échantillons à l'aide de ruban adhésif. Ensuite, à l’aide d’une pipette, introduisez les microtubules à la dilution souhaitée, observez l’image à un grossissement de 20 x et repérez le motif sur la plaquette de silicium avant d’appliquer une tension.

En raison de la profondeur de la chambre d'écoulement, des objectifs à longue distance de travail peuvent être nécessaires pour imager la surface supérieure de la chambre d'écoulement. La distance entre la surface de l'échantillon et la surface supérieure de la chambre d'écoulement est déterminée par l'épaisseur du ruban adhésif et doit être comprise entre 60 et 100 micromètres. Appliquez une tension allant jusqu'à un volt et observez la migration des microtubules.

Si un piégeage réversible des microtubules est souhaité, utilisez du vernis à ongles pour sceller la chambre d'écoulement afin d'éviter les dérives latérales et appliquez des tensions plus faibles, jusqu'à environ 0,5 volt. La migration peut être suivie en ajustant le plan focal vertical du microscope avec des tensions appliquées comprises entre environ 0,9 et 1,2 volt, les microtubules se localisant alors aux surfaces des électrodes.

Une tension plus élevée accélérera la migration et renforcera l'adhérence, mais une tension excessive induira l'électrolyse et la dépolymérisation. Microtubules, nous venons de vous montrer comment préparer des microélectrodes recouvertes de SAM pour le traçage des MT, car le revêtement par monocouche auto-assemblée empêche l'absorption des microtubules sur les microélectrodes. Cette procédure peut également être utilisée pour un traçage réversible des microtubules.

En outre, ce processus ne se limite pas aux microtubules, mais peut également être utilisé pour structurer des biomolécules en général. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.