L'adhésion des plaquettes et l'agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Le système Bio Flux est un instrument automatisé et un dispositif microfluidique permettant de réaliser des tests sur des cellules vivantes sous un écoulement cisaillant contrôlé. Ce système utilise une technologie microfluidique basée sur des plaques de puits pour intégrer des dispositifs de chambre d'écoulement à l'échelle micrométrique dans des plaques de puits normalisées SBS. BioFlex peut être utilisé pour mener des études d'adhésion et d'agrégation des plaquettes avec un débit élevé et des volumes sanguins réduits.

On ajoute du sang total marqué avec un colorant fluorescent dans les puits, puis on le fait circuler à travers les canaux. Sous un écoulement cisaillant contrôlé, des données de microscopie à haute résolution sont produites, permettant de quantifier l'adhésion et l'agrégation des plaquettes en présence de composés médicamenteux et d'autres paramètres variables. Bonjour, je suis Mike Schwartz du laboratoire de recherche et développement chez Flexion Biosciences.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure utilisant des cellules d'écoulement microfluidiques pour des tests d'adhésion des plaquettes. Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire pour divers essais en biologie vasculaire. Commençons donc.

Avant de réaliser l'expérience sur la cellule d'écoulement, les canaux microfluidiques de la plaque Bio Flux doivent être préparés avec un revêtement protéique d'intérêt ; dans cette expérience, du collagène de type I sera utilisé. Chacun des 24 canaux expérimentaux de la plaque Bio Flux est relié à un puits d'entrée et à un puits de sortie pour cette plaque. Le puits d'entrée est le puits situé à gauche, qui alimente le canal, et le puits de sortie est celui situé à droite. Diluez le stock de collagène de type I à une concentration de 200 microgrammes par millilitre.

Dans de l'acide acétique 0,02 molaire, 20 microlitres seront nécessaires pour chaque canal utilisé. Puisque cette expérience nécessite 11 canaux, préparez 200 microlitres de revêtement de collagène. Un canal reste non revêtu, mélangé par agitation douce à l’aide d’une pointe de micropipette.

Ajoutez 20 microlitres de revêtement dans chaque canal respectif en utilisant une micropipette pour délivrer le liquide dans l'embout intérieur du puits. Alimentez le canal microfluidique d'intérêt, comme illustré ici avec le colorant jaune, en incluant un canal sans collagène servant de contrôle négatif pour l'adhésion et l'agrégation des plaquettes. Une fois le revêtement de collagène ajouté à tous les canaux respectifs, fixez l'interface sur la plaque.

Si vous utilisez l'interface bio flux 1000, vous pouvez verrouiller les deux loquets sur la platine. Si vous utilisez l'interface Bio flux 200, serrez d'abord les quatre vis avec le doigt, puis, une fois qu'elles sont toutes en place, utilisez le tournevis dynamométrique pour les serrer complètement.

Le tournevis dynamométrique émettra un clic lorsqu'il atteindra le maximum. À l'aide du mode manuel du logiciel Bio Flux, appliquez la perfusion aux canaux d'intérêt à 2D par centimètre carré à partir de la sortie. Utilisez un objectif de faible grossissement au microscope pour localiser le puits d'entrée et observer le remplissage du poinçon intérieur opposé avec le liquide.

Vous devriez d'abord observer une petite bulle de liquide qui remplit lentement le poinçon intérieur après plusieurs minutes ; lorsque le poinçon intérieur d'entrée est rempli, arrêtez l'écoulement sur tous les canaux en appuyant sur « stop » dans le logiciel. Incubez la plaque à température ambiante pendant une heure. Pendant cette période d'incubation, vous pouvez commencer à préparer le sang total à la fin de l'incubation d'une heure.

Une fois le sang préparé, retirez l'interface et ajoutez un millilitre de PBS contenant des ions calcium et magnésium vers la sortie. Commencez la perfusion à partir du puits de sortie à deux dynes par centimètre carré et poursuivez la perfusion pendant 10 minutes. Après 10 minutes, arrêtez la perfusion. Après avoir retiré l'interface, éliminez l'excès de PBS des puits d'entrée et de sortie.

Ne jamais retirer le liquide qui remplit le poinçon intérieur. Pour bloquer les canaux, ajouter un millilitre de solution de blocage dans chaque sortie. La chambre à utiliser doit être perfusée à partir de la chambre de sortie à deux dynes par centimètre carré et la perfusion doit se poursuivre pendant 10 minutes.

Arrêter la perfusion après 10 minutes et retirer l'interface. Les canaux sont désormais prêts et peuvent être utilisés tout au long de la journée pendant que la plaque est en cours de revêtement au collagène. Pendant une incubation d'une heure, préparer du sang humain frais provenant d'un individu à jeun pour l'analyse par imagerie et l'écoulement dans la plaque.

Le sang doit être prélevé dans du citrate de sodium, anticoagulant, et utilisé dans les trois heures suivant son prélèvement. Tout d'abord, ajoutez un stock de calcium à quatre millimolaire dans le DMSO au sang selon un rapport de dilution de un à mille en volume par volume. Pour obtenir une concentration de quatre micromolaire en calcium, mélangez par inversions douces.

Ensuite, distribuez un millilitre du sang marqué au calcium AM dans dix microtubes de 1,5 mL. Ajoutez l'anticorps inhibiteur GP IIb/IIIa dans chaque tube à la dilution souhaitée. Veillez à inclure un témoin négatif sans anticorps et un témoin positif avec un anticorps non spécifique, en mélangeant par inversions douces.

Incuber les tubes à température ambiante pendant une heure, en mélangeant par retournement doux toutes les 10 minutes avant de réaliser l'expérience en cellule d'écoulement. Un protocole automatisé doit être configuré dans le module de contrôle bio flux pour le collagène.One. Mettre en place un protocole pour faire circuler le sang à dix neuf centimètres carrés pendant 10 minutes à partir de la sortie.

Eh bien, les paramètres d'acquisition de données du poste de travail BioFlex 1000 doivent être configurés, notamment l'acquisition des positions souhaitées de la platine aux longueurs d'onde de fitz et le réglage en laps de temps. Un plan typique d'acquisition d'images pour ce protocole comprendrait un champ de vision par canal, capturé à l'aide d'un objectif 10 x toutes les 30 secondes, sur une durée totale de 10 minutes. D'autres champs de vision et d'autres réglages de laps de temps sont également possibles.

Une fois le protocole automatisé et les paramètres d'acquisition des données configurés, revenir à la plaque BioFlex et retirer le liquide des deux côtés du canal, sauf au niveau des poinçons intérieurs. En prenant soin de travailler rapidement, ajouter 500 microlitres de sang pour chaque condition dans les puits de sortie de chaque canal. Remarquer que les puits de sortie sont utilisés pour l'administration du sang car ils offrent le trajet le plus court vers la zone d'observation et permettront ainsi une réaction plus immédiate du sang au revêtement de collagène.

En outre, placer le sang témoin sans anticorps dans un canal revêtu de collagène et dans un autre simplement bloqué. Placer la plaque sur le microscope de la station de travail BioFlex 1000 et fixer l'interface. Effectuer l'étalonnage de la liste des positions en localisant le premier point d'étalonnage, défini comme l'origine.

Ensuite, localisez et marquez le deuxième point d'étalonnage. Appliquez cet étalonnage à la liste de plateaux appropriée. Cela garantit que tous les emplacements d'observation sur la plaque peuvent être trouvés automatiquement.

Déplacez la platine vers l'un des canaux contenant du sang et réglez les paramètres de capture d'image, tels que le temps d'exposition et le gain, dans le logiciel de montage BioFlex. Lancez le workflow approprié en cliquant sur le bouton souhaité. Cela démarrera simultanément le protocole d'écoulement et l'acquisition d'images.

À la fin de l'expérience, retirez la plaque de la station de travail BIOFLU 1000 et éliminez-la conformément aux directives institutionnelles. En utilisant des canaux microfluidiques revêtus de collagène du système Bio Flux. Une formation agressive de thrombus est observée au fil du temps avec l'échantillon témoin de sang non traité.

En revanche, aucune formation de thrombus n'est observée avec le canal non revêtu. Dans une expérience récemment réalisée, la taille moyenne des agrégats dans les conditions de contrôle était de 2000 micromètres carrés. Le GP IIb IIIa est un médiateur puissant des interactions entre plaquettes et de la stabilisation de l'agrégation lorsqu'il est activé par l'adhésion au collagène ; comme le montre l'expérience après incubation avec un anticorps anti-GP IIb IIIa pendant une heure avant l'exposition au cisaillement, on observe une diminution de la taille des thrombus ainsi qu'une réduction de la fréquence de formation de thrombus.

Une réponse dépendante de la dose peut généralement être observée à dix neuf centimètres carrés et la valeur d'IC50 pour cet inhibiteur particulier était de 17 nanomolaire. L'inhibition maximale pour ce donneur par rapport au témoin sans anticorps était de 11 % à 10 dynes par centimètre carré. Une plaque à 48 puits à haut cisaillement est également disponible pour réaliser des expériences sur sang total jusqu'à 200 D par centimètre carré ou 5 000 secondes puissance moins un.

Nous venons de vous montrer comment utiliser des canaux d'écoulement microfluidiques pour réaliser des expériences de biologie vasculaire pertinentes sur le plan physiologique. Lors de l'exécution de ce protocole, il est important de se rappeler de diluer le collagène dans le tampon approprié. Utilisez toujours une technique de pipetage correcte afin d'éviter l'introduction de bulles d'air et respectez toujours les règles de biosécurité de votre laboratoire.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.