Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d'oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Cette procédure teste l'interaction in vivo entre deux régulateurs transcriptionnels d'Arabidopsis, SEUSS (abréviation de SEUSS, ou SEU) et LU HOMOLOG (ou LUH). En utilisant la complémentation de fluorescence biomoléculaire, SEUSS est fusionné au fragment terminal N de la protéine fluorescente jaune (YFP), tandis que LUH est fusionné au fragment terminal C de YFP-DNA provenant des deux constructions plasmidiques. Les protéines SEUSS-NYFP et LUH-CYFP sont ensuite transférées par bombardement dans des cellules épidermiques d'oignon afin de tester leur interaction.

Une interaction entre Seuss et LUH provoque l'association des fragments terminal N et terminal C de YFP dans les noyaux, entraînant une fluorescence de YFP dans les noyaux. Après une incubation de 16 à 20 heures à l'obscurité, les écales épidermiques d'oignon sont observées au microscope à fluorescence afin de visualiser la fluorescence. Bonjour, je suis Courtney Hollander du laboratoire du Dr Zhi Lu du Département de biologie cellulaire et génétique moléculaire de l'Université du Maryland.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de tester l'interaction entre protéines dans des cellules d'oignon à l'aide du canon à gènes BioRad Helios. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour analyser les interactions entre protéines ainsi que la localisation des protéines dans les cellules végétales. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, préparez les cartouches pour le canon à gènes Helios en suivant le protocole Joe Video de Woods et Zeto 2008, qui décrit en détail la procédure de préparation des cartouches pour chaque préparation. Cinquante microgrammes d'ADN plasmidique total sont mélangés avec 12,5 milligrammes de particules d'or et une solution de PVP à 0,5 milligramme par millilitre pour la BIFC. En combinant la même préparation de cartouche, les deux ADN plasmidiques des protéines en interaction présumée Seuss fusionnée à la moitié N-terminale de YFP, abrégée seus, NYFP, et l'homologue de LU fusionné à la moitié C-terminale de YFP, abrégé L-U-H-C-Y-F-P, sont utilisés.

La quantité totale est de 50 microgrammes par préparation, permettant d'obtenir jusqu'à 50 cartouches avec un microgramme d'ADN par 0,25 milligramme d'or par cartouche. Chaque cartouche est destinée à un tir unique. Après la préparation des cartouches, testez-les afin de déterminer si les particules d'or sont efficacement propulsées.

Enveloppez un carré de paraforme autour d'une boîte de Pétri. Réglez ensuite la pression d'hélium entre 150 et 200 psi et tirez les cartouches nouvellement fabriquées dans le carré de paraforme. Observez de fines particules dorées sur le paraforme.

Différentes quantités de particules d'or peuvent être propulsées sur le parfum à différentes pressions d'hélium. Toutefois, en l'absence de différence significative, choisissez la pression la plus faible pour le bombardement. Ce test indique également la zone couverte par chaque tir.

Pour préparer les tissus d'oignon, retirez la peau externe d'un oignon jaune de grande taille à l'aide d'une lame de rasoir propre et aiguisée. Découpez une zone rectangulaire de deux sur huit centimètres, d'une profondeur de quatre à cinq couches. Retirez le tissu d'oignon rectangulaire et jetez les deux couches externes.

Coupez les couches restantes de l'oignon en morceaux carrés d'environ 1,5 centimètre de côté. Placez les morceaux d'oignon dans une boîte de Pétri contenant des disques de papier filtre de trois mm. Humidifiez avec de l'eau stérile et couvrez la boîte de Pétri.

Les morceaux d'oignon sont prêts pour le bombardement. Chargez d'abord les cartouches dans les porte-cartouches ronds blancs ; insérez des cartouches contenant des constructions plasmidiques différentes dans des porte-cartouches distincts. Chaque porte-cartouche peut contenir jusqu'à 12 cartouches, soit 12 tirs.

Trois supports différents sont chargés ici. Le premier support contient des cartouches avec un promoteur fort et constitutif 35 S-G-F-P-A provenant du virus de la mosaïque du chou-fleur. Ce plasmide sert de témoin positif.

Le deuxième support est chargé avec les cartouches expérimentales contenant une quantité égale de S-E-U-N-Y-F-P et de L-U-H-C-Y-F-P. Le troisième support de cartouche est chargé avec des cartouches contenant un mélange équimolaire du vecteur spine de puck et de l'assaisonnement LUH puck. Ceci sert également de contrôle négatif.

Insérez la batterie et le nouveau manchon de canon dans le canon à gènes Helios. Assurez-vous que le manchon de canon et le canon sont chacun équipés de leur joint torique respectif. Ensuite, insérez un porte-cartouche vide dans le canon à gènes, en orientant la marque numéro 12 sur le porte-cartouche vers le haut du canon.

Avancez le support de cartouche une ou deux fois pour vous assurer qu’il est correctement inséré. Ensuite, fixez le pistolet sur la bouteille d’hélium et réglez la pression entre 150 et 200 PS. Portez une protection auditive et tirez quelques fois avec le pistolet en maintenant le bouton latéral enfoncé tout en actionnant la gâchette. Tirer avec le support de cartouche vide permet de nettoyer la chambre du pistolet et garantit une pression stable.

Avant de tirer l'ADN, tirer un morceau d'oignon ici peut servir de contrôle négatif pour la fluorescence de fond. Pour tirer les particules d'or revêtues d'ADN, retirez le support de cartouche vide et insérez le premier support de cartouche chargé contenant le contrôle positif. Avancez le support de cartouche afin que la cartouche destinée à être tirée soit positionnée en bas du support de cartouche.

Placez maintenant des morceaux d'oignon au centre d'une boîte de Pétri vide, la couche la plus interne de l'oignon orientée vers le haut. Appuyez le tube interne du pistolet à gènes contre la boîte de Pétri et déclenchez le tir. Passez à la cartouche suivante et tirez sur un morceau d'oignon différent.

Répétez cette étape jusqu'à ce que quatre à cinq morceaux d'oignon soient tirés. Chaque morceau d'oignon n'est tiré qu'une seule fois après le tir. Transférez le morceau d'oignon bombardé dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide de trois mm pour tirer les cartouches expérimentales.

Passer au cartouche Holden. Numéro deux, pensez à remplacer le manchon du canon afin d'éviter toute contamination. Tirer quatre à cinq morceaux d'oignon comme vient d'être montré pour le témoin positif.

Ensuite, passez au cartouche Holden numéro trois, contenant l'ADN témoin négatif. Et de nouveau, projetez quatre à cinq morceaux d'oignon.

Changer la douille du barillet pour éviter toute contamination. Après le bombardement, couvrir les boîtes de Petri contenant les morceaux d'oignon avec leurs couvercles.

Enveloppez-les avec du paraforme pour éviter le dessèchement. Incubez les morceaux d'oignon à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 16 à 48 heures. Une fois le bombardement terminé, éteignez le gaz et relâchez la pression avant de déconnecter le canon à gènes du réservoir d'hélium, dévissez le manchon du canon et retirez le support de cartouche et les cartouches usagées.

Enfin, nettoyez les supports de cartouche et les douilles internes en les plongeant dans un bécher contenant de l’eau savonneuse et en les soumettant à une sonication pendant 20 minutes. Rincez ensuite à l’eau pour éliminer tous les résidus de savon.

Imbiber dans de l'éthanol à 70 % pendant une heure, puis sécher sur des serviettes en papier. Procéder à l'observation des morceaux d'oignon 16 à 20 heures après le bombardement. Après avoir incubé les morceaux d'oignon bombardés pendant 16 à 20 heures à température ambiante, utiliser une pince à extrémités plates pour détacher lentement une seule couche cellulaire de l'épiderme interne de l'oignon.

C’est la couche qui fait face directement à l’arme pendant le bombardement. Déposer la couche pelée sur une goutte d’eau sur une lame de microscope avec une lamelle à couvrir. Mais veillez à minimiser les bulles.

Observer la fluorescence de GFP ou de YFP à l’aide d’un microscope à fluorescence, comme l’axio observer zes, point Z un présenté ici en champ clair au microscope. Vérifiez d’abord la présence d’un courant cytoplasmique afin de s’assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire.

Exposer la lame à la lumière du champ clair pendant quelques minutes afin de réchauffer le tissu d'oignon, puis rechercher le flux cytoplasmique en mouvement. Le flux cytoplasmique n'est pas toujours facile à observer, donc ne pas se décourager s'il n'est pas clairement visible. Pour la détection en fluorescence, utiliser les filtres d'excitation et de détection appropriés pour GFP ou YFP. Vérifier également les contrôles négatifs, qui correspondent aux morceaux d'oignon transfectés avec un plasmide non fluorescent.

Des signaux jaunes pâles peuvent apparaître à partir des cellules lésées, des débris et des oignons. Vérifiez également les contrôles positifs. Le plasmide contenant le rapporteur fluorescent exprimé de façon constitutive.

Une fluorescence GFP est observée dans certaines cellules, mais pas dans toutes. Des bulles d'air peuvent également produire une fluorescence de fond. La présence de signaux GFP visibles dans les cellules épidermiques de l'oignon indique que les cartouches, les tissus d'oignon et le tir du canon à gènes ont été correctement préparés et réalisés.

On observe ici la forte fluorescence provenant du plasmide positif 35 SGFP. La forte fluorescence est visible dans toute la cellule, y compris dans le noyau et le cytoplasme. L'image en champ clair permet de distinguer les contours correspondants des cellules et des noyaux.

Toutes les cellules ne sont pas transformées. Le signal fluorescent YFP est détecté dans le noyau des cellules d'oignon lorsque la combinaison expérimentale Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P est bombardée dans les cellules d'oignon, indiquant que Seuss, NYFP et L-U-H-C-Y-F-P interagissent in vivo. Toutefois, cette fluorescence, médiée par l'interaction, est nettement plus faible que la fluorescence médiée par 35 SGFP dans le contrôle positif.

De plus, les facteurs de transcription SEUS et LUH sont localisés dans les noyaux. Ainsi, la fluorescence YFP n'est observée que dans le noyau. En outre, le nombre de cellules fluorescentes est nettement inférieur à celui du contrôle positif 35 SGFP.

Cela s'explique par le fait que la B FFC ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires sont exprimés dans les mêmes cellules d'oignon. Aucun signal fluorescent n'est détecté dans les oignons bombardés avec le porte-cartouche numéro trois, contenant un mélange de puck spine, de vecteur et de L-U-H-C-Y-F-P, comme prévu pour le témoin négatif. Nous venons de vous montrer comment bombarder des cellules d'oignon afin de tester des interactions entre protéines à l'aide du système de canon à gènes BioRad Helios.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des contrôles positifs et négatifs appropriés et de savoir que la fluorescence BIFC peut être plus faible en intensité et moins nombreuse en termes de cellules fluorescentes. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.