Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Cette expérience vise à déterminer si deux protéines interagissent dans les cellules et à préciser certaines caractéristiques des sites de cette interaction. Tout d'abord, les cellules sont transfectées avec des constructions d'expression codant pour les deux protéines d'intérêt, dont l'une est fusionnée à l'extrémité terminale d'une protéine fluorescente fragmentée et l'autre à l'extrémité C complémentaire de la même protéine fluorescente fragmentée. Après avoir permis aux cellules transfectées de développer un signal fluorescent en culture, les complexes protéiques sont visualisés par imagerie et immunoblotting.

Ensuite, les images recueillies sont exportées vers un logiciel d'analyse d'images tel qu'Image J afin de quantifier l'intensité moyenne de fluorescence par cellule. Dans une expérience contrôlée, les résultats de BIFC peuvent démontrer les interactions entre protéines ainsi que la localisation de ces complexes, comme les domaines SH3 de la protéine échafaudante intersectant et le domaine riche en proline de PI3KC2β. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la colocalisation, l'immunoprécipitation et le FRET est que la BIFC permet la localisation spatialisée d'interactions transitoires plus faibles au sein de la cellule. De plus, cette méthode ne nécessite pas de post-traitement d'images intensif, contrairement à ce qui est observé avec le FRET.

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la transduction du signal, telles que les protéines X et Y interagissent-elles, et si oui, dans quels compartiments spécifiques ces complexes se localisent-ils dans la cellule ? En général, les débutants éprouvent des difficultés car ils n'ont pas choisi la configuration appropriée pour exprimer leur biopsie. Protéines d'intérêt marquées Commencez par sélectionner un des fluorophores multiples pour les protéines de fusion BIFC.

Considérez que les extrémités aminoterminale et carboxyterminale de Venus sont capables de former un complexe à 37 degrés Celsius, tandis que les fragments Y-F-P-B-I-F-C nécessitent une pré-incubation à 30 degrés Celsius. Concevez des vecteurs d'expression pour l'ajout de marqueurs aux protéines d'intérêt en tenant compte de la manière dont l'attachement des fragments BIFC pourrait affecter la fonction des protéines d'intérêt. Par exemple, la famille des RAs et les GTPases sont modifiées par des lipides au niveau de l'extrémité carboxyterminale et ne peuvent pas être marquées à cette extrémité sans perturber cette modification.

Effectuez toujours des expériences pilotes pour déterminer les conditions de transfection. Surveillez également les cellules par microscopie à fluorescence afin d'identifier le moment optimal pour le développement du signal. Ensuite, réalisez une analyse western blossom pour confirmer une expression équivalente des constructions.

Il est important de réaliser une immunomarquage pour la marque HA ou flag afin de vérifier que l'ajout des fragments BIFC ne modifie pas la localisation cellulaire des protéines d'intérêt pour chaque plaque d'échantillons. Déposer 1,3 × 10⁵ cellules dans chaque puits d'une plaque avec fond en verre et dans deux puits d'une plaque à six puits, puis laisser les cellules s'attacher toute la nuit dans un incubateur à 37 °C. Le lendemain, préparer les ADN pour la transfection par lipofection ou une autre méthode préférée.

Commencez par diluer l'ADN dans 250 microlitres de DMEM sans sérum comme témoin de transfection. Ajoutez le CFP à un cinquantième, correspondant à la quantité totale de vos ADN BIFC. Diluez ensuite le lipofectamine dans 250 microlitres de DMEM sans sérum, en utilisant 10 microlitres de lipofectamine par microgramme d'ADN.

Mélangez les dilutions d'ADN et de lipide, puis incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Rincez les cellules deux fois avec du DMEM sans sérum, préchauffé. Ajoutez deux millilitres de DMEM sans sérum dans chaque plaque avec fond en verre ou puits d'une plaque de six puits.

Ensuite, répartir uniformément chaque mélange de transfection entre un plat avec fond en verre et deux puits d'une plaque à six puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. Enfin, retirer le milieu de transfection et le remplacer par du milieu DMEM complet supplémenté en 10 % de FBS.

Incubez les cellules pendant la durée déterminée lors d'expériences préliminaires afin d'obtenir les niveaux d'expression nécessaires des protéines d'intérêt. Examinez les cellules transfectées au microscope fluorescent en épifluorescence pour vous assurer que le témoin positif est fluorescent. Rincez les cellules trois fois avec du PBS pour l'imagerie de cellules vivantes.

Placer les cellules dans un milieu dépourvu de colorants indicateurs. Pour l'imagerie de cellules fixées, ajouter du paraformaldéhyde à 2 % et placer sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, rincez les cellules trois fois avec du PBS, maintenant recouvert d'un millilitre de PBS, et conservez à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius, puis lysez immédiatement les cellules dans la boîte de culture à six puits. Pour les analyses par immunotransfert (Western blot), il est important que toutes les cellules soient préparées en même temps afin que les cellules lysées soient représentatives des cellules observées en microscopie. Réalisez un immunotransfert (Western blot) pour vérifier que les protéines marquées sont exprimées à des niveaux équivalents.

Lors de l'imagerie de cellules au microscope confocal, il est important de maintenir les paramètres constants tout au long de l'expérience afin que la fluorescence soit comparable entre les échantillons. Veillez à imager des cellules individuelles pour lesquelles les pixels ne sont pas saturés. Étant donné que le CFP a été inclus comme témoin de transfection, sélectionnez uniquement les cellules positives au CFP pour l'analyse des signaux BIFC.

Quantifiez la fluorescence à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images tel qu'ImageJ. Ouvrez les fichiers d'images dans ImageJ. Allez dans Analyser puis définir les mesures. Cochez les cases surface et valeur moyenne de gris dans la boîte de mesures. Notez que, dans cet exemple, les images veineuses ont été colorisées en vert de manière artificielle et les images CFP, colorisées en rouge de manière artificielle.

À l’aide de l’outil de sélection polygonale, tracez un contour autour du bord de l’ensemble de la cellule sur le canal CFP en laissant ce contour en place. Passez au canal YFP. Allez dans analyser, mesurez la valeur moyenne de gris qui reflète l’intensité moyenne de fluorescence par cellule pour chaque image.

Tracer un cercle dans le canal YFP dans une zone ne contenant pas de cellule. Effectuer une mesure pour cette zone afin d'obtenir le fond du champ. Soustraire le fond du champ de chaque image.

Enfin, pour calculer l'intensité moyenne de fluorescence pour une population de cellules, faites la moyenne de la valeur moyenne du degré moins le fond pour l'ensemble des cellules imagées dans un échantillon. Quantifiez idéalement 60 cellules réparties sur trois expériences. La protéine d'échafaudage multi-domaines intersecting régule la survie neuronale par la régulation d'une nouvelle classe de kinase à inositol triphosphate de type deux, PI trois KC deux beta. Les domaines SH trois d'intersecting interagissent avec la région riche en proline du bout amino-terminal de PI trois KC deux beta. La transfection de intersecting marqué VN avec PI trois KC deux beta marqué VC entraîne un signal fluorescent dans le canal YFP, coloré artificiellement en vert, indiquant la formation d'un complexe.

Le CFP, ici en pseudo-couleur rouge, est utilisé comme témoin pour marquer les cellules transfectées. Des mutations dans le domaine riche en proline de la PI trois KC deux bêta, qui perturbent la co-précipitation de l'intersectine et de la PI trois KC deux bêta, réduisent le signal BIFC. Cette différence de signal BIFC n'est pas due à des variations d'expression des protéines de type sauvage et de la PA PI trois K. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement effectuée. Lors de l'exécution de cette procédure, vous devez vous assurer de réaliser les témoins appropriés et de vérifier l'expression des protéines afin de garantir que les différences de signal BC sont dues à des différences dans la formation du complexe et non à l'expression des protéines suivant cette procédure.

D'autres techniques, comme la plasmonique de surface sur les résidents, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que quelles sont les différentes affinités de ces complexes les uns par rapport aux autres ?