Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Pour tester l'interaction entre deux protéines, les deux gènes d'intérêt doivent être clonés dans nos vecteurs BF et en utilisant la technique d'insertion Gateway. Ces constructions sont transformées dans la souche bactérienne Agrobacterium GV3101. Les cultures bactériennes GV3101 contenant chaque construction seront mélangées et co-infiltrées dans les feuilles.

Si les deux protéines candidates interagissent l'une avec l'autre, le signal YFP peut être observé à l'aide d'un microscope à fluorescence. Le but principal de la technique BFC est de tester l'interaction entre deux protéines. In vivo, nous avons créé une série de vecteurs BFC et de type double hybride compatibles avec le système Gateway, qui fournissent aux chercheurs des outils faciles à utiliser pour réaliser des tests double hybride BFC et ISTO.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer la facilité d'utilisation de notre système BFC. Pour tester les interactions entre protéines d'une manière indépendante du système d'expression, vous devez d'abord préparer la culture bactérienne GV3101.

Vous devez prélever une colonie unique à partir de votre boîte et l'ensemencer dans cinq millilitres de milieu YEB contenant les antibiotiques appropriés. Ensuite, vous devez agiter ces cultures toute la nuit à 28 degrés. La vitesse est de 200 tours par minute.

Les cultures bactériennes doivent être prêtes le lendemain matin. Vérifiez que les bactéries D ont trop poussé. Sortez les cultures de l'incubateur et transférez un mâle de chaque culture dans un tube stérile de centrifugation de 1,5 mL.

Placer les tubes de centrifugation dans une centrifugeuse de bureau. Centrifuger les bactéries à 1000 G pendant 10 minutes à température ambiante, puis éliminer le surnageant. Ensuite, observer le culot en ajoutant un millilitre de milieu d'infiltration et en réhomogénéisant par quelques pipetages.

Répétez l'étape de lavage encore deux fois. Cette étape est importante car elle permet d'éliminer les traces d'antibiotiques présents dans le milieu bactérien, lesquels pourraient nuire à la survie de vos plantes après l'infiltration. Après le dernier lavage, resuspendez le culot dans 0,5 mL de milieu d'infiltration, puis mesurez l'absorbance à 600 nm de cette suspension bactérienne à l'aide d'un spectrophotomètre, en utilisant le milieu d'infiltration comme témoin de blanc.

Après la mesure de la DO, vous devez ajuster la DO à l’aide du milieu d’infiltration. La DO finale doit être comprise entre 1 et 1,2. Vous devez préparer toutes les suspensions bactériennes avant de passer à l’étape suivante.

Transférez une quantité égale de suspensions bactériennes correspondant à vos deux protéines candidates et mélangez-les dans un nouveau tube masculin de 1,5 ml. Le mélange bactérien négatif est désormais prêt à être infiltré. Préparez toutes les combinaisons et n’oubliez pas d’inclure un témoin négatif. Vous devez utiliser cinq à six plantes de type sauvage et en bon état pour l’infiltration.

Vous pouvez retirer les plantes de la chambre de croissance et les placer sous lumière pendant une heure avant l'infiltration afin d'ouvrir les stomates. Cela facilitera le processus d'infiltration. Aspirez environ 100 microlitres de bactéries en suspension dans du Resus.

Mélanger presque entièrement avec une seringue à embout glissé sans aiguille. Placer l'extrémité de la seringue contre la face inférieure de la feuille. Maintenir la face supérieure de la feuille avec le doigt.

Appuyez généralement sur le piston. Vous devriez pouvoir observer le liquide se diffuser à travers la feuille, car le mésophylle paraît plus mince. Après l'infiltration, marquez l'air entré avec un stylo-feutre. Sinon, après deux jours, vous ne pourrez plus identifier la zone infiltrée. Si vous devez infiltrer avec des mélanges bactériens différents, assurez-vous de vaporiser vos gants avec de l'éthanol à 50 % ou de changer de gants entre chaque infiltration.

Essayez de laisser un espace d'un mètre entre les infiltrations afin d'éviter toute contamination croisée. Les signaux de PFA doivent être surveillés toutes les 24 heures à partir de l'infiltration, pendant cinq jours. Vous pouvez utiliser deux manchons de protection de tailles différentes pour maintenir l'échantillon.

Tout d'abord, déposez une goutte d'eau mini sur un manchon de couverture encoché. Ensuite, découpez un petit morceau de tissu de couteau à l'intérieur de la zone infiltrée. Essayez d'éviter la veine nauséeuse dans l'échantillon.

Placez le tissu de lame coupée dans l'eau sur la lame porte-objet, recouvrez-le à l'aide d'une petite capsule et appuyez doucement. L'échantillon peut désormais être observé au microscope Mexico. Ici, nous utilisons ce microscope confocal NACA T CSS P deux Mexico pour visualiser le signal BIFC.

Même une odeur régulière du Mexique peut être utilisée. La microscopie confocale fournit de meilleures images et permet de détecter des signaux faibles. Vous pouvez utiliser le paramètre YFP pour détecter les signaux VFC dans ce système P deux des NCAs.

Vous pouvez simplement double-cliquer sur ce préréglage YFP ici, ce qui activera automatiquement l'excitation et définira la plage de détection d'émission. Si vous utilisez un système différent, veuillez consulter le manuel pour configurer correctement les paramètres. Nous espérons qu'après avoir visionné cette vidéo, vous serez en mesure de réaliser la BFCE pour tester les interactions entre protéines à l'aide du système d'expression unbe MI Transcend.

Vous pouvez également appliquer cette procédure aux plantes de tabac et AY. Nos vecteurs BFC contiennent respectivement une étiquette HA et une étiquette flag, vous permettant ainsi d'effectuer une immunoprécipitation covalente pour valider les interactions si nécessaire.