Évaluation des immunologiquement pertinents dynamiques tertiaires Caractéristiques structurelles de l'épidémie de VIH-1 séquence de la boucle V3 de la Couronne par R2

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer les préférences structurales dynamiques de la séquence peptidique de la couronne V3 de la souche R2 du VIH par repliement AR, et de corréler les résultats avec les sensibilités connues à la neutralisation de la souche R2. Cela est réalisé en sélectionnant un fragment approprié de la couronne de la boucle V3 de R2 à replier en AR bonni. Dans un deuxième temps, la simulation du repliement est effectuée, ce qui explore toutes les confirmations possibles du fragment de la couronne R2 et enregistre les confirmations les plus probables dans un fichier de type pile.

Ensuite, les confirmations enregistrées sont analysées afin de déterminer la préférence structurale dynamique de la couronne R deux V trois, ce qui pourrait expliquer sa sensibilité à la neutralisation. Les résultats obtenus révèlent une préférence pour un brin bêta rigide aux positions 12 à 14 de la boucle V trois, basée sur la structure secondaire, la préférence et la distribution d'énergie de l'ensemble des confirmations recherchées. Bonjour, je suis Timothy Cardozo, qui vous parle depuis mon laboratoire du Département de pharmacologie de la faculté de médecine de l'Université de New York.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de repliement protéique ab initio d'une boucle flexible sur une protéine virale immunogène du VIH-1 appelée GP120. Cette boucle flexible est connue sous le nom de boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe de surface du virus VIH-1, et son extrémité est appelée la couronne de la boucle V3. C'est cette région que nous allons replier.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour nous aider à identifier des voies productives menant à la conception réussie de vaccins contre le VIH. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, sélectionnez la séquence du domaine V3 de la couronne à replier in silico.

Des études antérieures menées dans ce laboratoire indiquent que les positions 10 à 22 de n'importe quelle séquence de la boucle V3 donnent les meilleurs résultats. Effectuez les expériences de repliement d'arménio à l'aide des menus déroulants conviviaux de l'interface graphique utilisateur ou GUI du logiciel de modélisation moléculaire ICM Pro. Tout d'abord, la structure atomique tridimensionnelle du peptide correspondant à cette séquence doit être construite dans l'espace virtuel du système informatique. Pour construire la structure atomique tridimensionnelle, accédez au menu fichier et sélectionnez nouveau.

Cela affichera un écran comportant plusieurs onglets. Sélectionnez l'onglet peptide et collez ou saisissez la séquence dans la zone de texte. Cliquez sur OK pour construire la structure tridimensionnelle du peptide.

La structure apparaîtra dans la fenêtre graphique d'ICM. Une fois la structure tridimensionnelle construite, accédez au menu de mécanique moléculaire et sélectionnez minimiser, ce qui affichera un menu latéral. Dans le menu latéral, choisissez global.

Cela affichera un écran comportant plusieurs champs de saisie et cases à cocher déjà sélectionnés selon les paramètres par défaut. Si nécessaire, modifiez la sélection pour choisir le peptide à replier. Ajustez la durée et la précision de la simulation en modifiant respectivement le nombre de mouvements globaux et le nombre d'appels aux minimisations locales.

Sélectionnez tout pour le repliement de tous les atomes du peptide. Ensuite, sélectionnez enregistrer le film pour créer un fichier vidéo du repliement. Enfin, cliquez sur appliquer pour démarrer le repliement dans la fenêtre graphique.

L'algorithme commence à replier le peptide en différentes conformations, calculant et enregistrant l'énergie du peptide pour chaque conformation. Une fois terminé, la conformation la plus stable sur le plan énergétique du peptide, ainsi que les conformations alternatives présentant une énergie presque identique, seront identifiées et visualisées sur l'ordinateur lors du repliement du peptide. L'utilisation de l'interface graphique montre à quoi ressemble le repliement, mais ne permet pas une sélection idéale des paramètres pour le repliement du domaine V trois boucle couronne.

À cette fin, il est préférable d'effectuer le repliement à partir de la ligne de commande non graphique en utilisant un script. Un script est simplement une série de commandes textuelles enregistrées ligne par ligne dans un document ou un fichier texte, qui sont ensuite transmises automatiquement au programme ICM et exécutées les unes après les autres pour replier la boucle V trois à l’aide d’un script de lignes de commande. Commencez tout d'abord par rédiger un fichier texte à enregistrer sur le disque dur de l'ordinateur dans un répertoire local. Comme précédemment, commencez par construire le peptide dans l'espace virtuel de l'ordinateur.

Ensuite, donnez un nom à la simulation et définissez le nombre de variables libres, qui correspondent aux liaisons chimiques du peptide laissées libres pour pivoter lors du repliement. Spécifiez ensuite la durée d'exécution de la simulation pour un repliement optimal de la boucle V trois. Cette durée dépendra du nombre de variables libres identifiées à l'étape précédente afin de déterminer la précision de la recherche conformationnelle dans l'expérience ; réglez le nombre d'étapes de recherche à effectuer dans chaque minimum local.

Ensuite, définir d'autres paramètres qui ont été optimisés pour la simulation sur la base de recherches antérieures, notamment la minimisation de température, le gradient et la distribution de probabilité. Après avoir défini les paramètres expérimentaux, indiquer quelles calculs d'énergie seront utilisés pendant le repliement. Ici, l'énergie de Vander Vi est indiquée par VW interne au peptide.

L'énergie est indiquée par 14 énergies de liaison hydrogène indiquées par HB électrostatique. L'énergie est indiquée par El Salvation. L'énergie est notée SF et l'entropie est notée EN. Spécifiez les paramètres finaux, incluant les angles préférés de la chaîne principale et des chaînes latérales à explorer ainsi que la conformation initiale.

Enfin, écrivez la commande pour exécuter et enregistrer le calcul. Une fois que le script a été écrit et enregistré sous forme de fichier texte, exécutez-le à partir de l'invite de commandes du système d'exploitation de l'ordinateur. Comme précédemment, la conformation la plus stable sur le plan énergétique du peptide, ainsi que les conformations alternatives possédant une énergie comparable, seront identifiées et enregistrées dans le fichier du projet pour être visualisées sur l'ordinateur.

Une fois le calcul terminé, ouvrez le fichier en sélectionnant « ouvrir le fichier » dans le menu déroulant EE. Affichez la molécule en cliquant sur la case à cocher située à côté dans le panneau de l'espace de travail, puis sélectionnez la vue superposée de la mécanique moléculaire. Pour visualiser la pile classée par énergie des meilleures conformations du peptide issues du repliement, cliquez sur l'outil de tracé situé en bas à droite du panneau de la pile afin de représenter les résultats.

Cliquez d'abord sur OK dans la fenêtre résultante, puis sur l'onglet central du graphique appelé best confo. Ensuite, cliquez sur la première ligne du tableau des résultats, qui correspond à la conformation de plus basse énergie trouvée lors de la recherche. La structure du peptide s'ajustera selon sa conformation de plus basse énergie dans la fenêtre graphique.

Analyser cette conformation pour détecter des caractéristiques semblables à un brin bêta ou à une hélice alpha, en particulier dans les cinq premières positions du peptide. Pour ce faire, sélectionner cette région dans la séquence et cliquer sur l'icône de bâtonnet située en haut à gauche de l'écran afin d'afficher tous les atomes. Ensuite, il faut analyser la pile de résultats énergétiques afin de tracer les meilleures conformations.

Si la conformation d'énergie la plus basse est séparée par un écart important des autres conformations, cela indique une tendance vers une structure rigide. Pour évaluer les résultats, ouvrez le flacon du projet et sélectionnez l'affichage par pile de mécanique moléculaire ; un tableau des conformations de la pile apparaîtra. Visualisez les conformations de la pile en cliquant sur l'icône du diagramme en histogramme.

Enfin, cliquez sur lecture de la pile de mécanique moléculaire pour créer un film à partir de la pile et visualiser les préférences conformationnelles mises en évidence par le repliement ici. Les résultats du repliement de R deux sont présentés. La conformation n'est pas en hélice alpha et correspond à une boucle aléatoire, comme prévu pour les boucles V trois, notamment dans le fragment allant du résidu 12 à 14.

Dans la boucle V trois, une préférence marquée pour la conformation en feuillet bêta est observée tout au long de l'empilement, et très peu de conformations en hélice alpha sont détectées. Une conformation locale en feuillet bêta est reconnue à sa forme linéaire allongée. Cette région correspond à la séquence inhabituelle isoleucine-proline-méthionine de la souche R deux, une séquence rare chez les souches de VIH à cette position et que l'on suppose responsable des caractéristiques atypiques de R deux.

En outre, un écart énergétique d'environ trois unités est observé entre la conformation de plus basse énergie et la conformation de deuxième plus basse énergie. Ainsi, la structure quitte brièvement la conformation de plus basse énergie moins de 1 % du temps, ce qui suggère que la couronne R deux V trois et sa conformation locale de contrainte bêta aux positions 12 à 14 possèdent une structure plus rigide plutôt qu'étant complètement flexible de nature. Nous venons de vous montrer comment replier une séquence de couronne en boucle V trois à l'aide de l'algorithme abio implémenté dans le logiciel ICM, et nous vous avons montré comment analyser les résultats à l'aide de la souche R deux du virus du VIH.

Par exemple, lors de la réalisation de cette procédure, il est important de choisir soigneusement l'identité du peptide de repliement correspondant à un fragment de la couronne V trois, et il est également essentiel d'interpréter les résultats en tenant compte des préférences conformationnelles et de l'énergie, en consultant un spécialiste en modélisation moléculaire. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.