Déterminer le nombre de cellules pendant la culture cellulaire en utilisant le compteur cellulaire Sceptre

Le compteur de cellules Scepter est un dispositif automatisé portable permettant de compter les cellules, de surveiller leur diamètre et leur volume, ainsi que d'évaluer la santé et la qualité des populations cellulaires. Il présente des avantages significatifs par rapport à d'autres méthodes de comptage, notamment une meilleure précision, une utilisation simplifiée et un coût réduit pour le comptage des cellules. À l'aide du Scepter, suivez les instructions affichées sur l'écran graphique pour aspirer les cellules dans le capteur jetable.

Les cellules sont ensuite comptées et l'appareil fournit les concentrations cellulaires et les statistiques, qui peuvent être transférées sur un ordinateur et analysées. Bonjour, je suis Sonya. Je suis chercheuse scientifique chez Millport, et aujourd'hui je vais vous montrer comment utiliser le Scepter.

Le décompte cellulaire est une étape nécessaire mais fastidieuse pour la culture cellulaire in vitro. Des concentrations cellulaires constantes garantissent la reproductibilité et la précision expérimentales. Le décompte des cellules est important pour surveiller la viabilité et le taux de prolifération cellulaire, évaluer les cellules immortelles ou transformées avant leur semis pour des expériences ultérieures, des transfections ou des infections, ainsi que pour la préparation d'essais cellulaires, malgré le besoin de rapidité et de précision.

Dans le décompte cellulaire, 71 % des 400 chercheurs interrogés effectuent le décompte des cellules à l’aide d’un cytomètre hématique. Bien que la cytométrie hématique soit peu coûteuse, elle est laborieuse et sujette aux biais et aux mauvaises utilisations de l’opérateur, ce qui conduit à des décomptes inexactes. Les sources d’erreur en cytométrie hématique incluent une répartition inégale des cellules dans l’échantillon, un nombre excessif ou insuffisant de cellules dans l’échantillon.

Décisions subjectives quant à savoir si une cellule donnée se trouve dans la zone de comptage définie. Contamination du cytomètre sanguin, variations entre utilisateurs et variations du taux de remplissage du cytomètre sanguin afin d'atténuer la monotonie associée au comptage manuel. 29 % des chercheurs comptent les cellules à l’aide de dispositifs automatisés de comptage cellulaire.

Cependant, pour la plupart des chercheurs, le prix associé à ces grands instruments de laboratoire constitue un obstacle à leur utilisation. Le compteur de cellules Scepter est un dispositif automatisé portable qui offre l'automatisation et la précision du comptage Coulter à un coût relativement faible, dans un format manuel facile à utiliser. Le système utilise le principe Coulter de détection des particules par impédance, dans un format miniaturisé, en combinant matériel analogique et numérique pour le traitement des signaux de détection, le stockage des données et l'affichage graphique.

Le capteur jetable est conçu avec une zone de détection cellulaire microfabriquée qui permet de discriminer selon la taille et le volume des cellules avec une résolution submicrométrique et subpicolitrique, améliorée par des canaux de manipulation précise des liquides et des composants électroniques. Le compteur de cellules Scepter affiche graphiquement les statistiques des populations cellulaires sous forme d'un histogramme utilisable. Le compteur de cellules Scepter commence par diluer une suspension monocellulaire dans du sérum physiologique tamponné au phosphate.

Une concentration de 10 000 à 500 000 cellules par millilitre est optimale. Transférez 100 microlitres de cellules diluées dans un tube microview de 1,5 millilitre. Allumez le compteur de cellules Scepter en appuyant et en maintenant enfoncé l’interrupteur situé à l’arrière de l’appareil, puis attendez l’apparition des instructions à l’écran.

Lorsque vous y êtes invité, fixez un capteur à l'extrémité de l'unité stylet, en orientant le panneau de détection des électrodes vers l'avant de l'instrument. Les capteurs Scepter sont constitués d'une chambre d'échantillonnage moulée avec précision, dotée d'une zone de détection électronique et d'électrodes intégrées de détection cellulaire. Ces capteurs permettent de discriminer la taille des cellules avec une résolution submicrométrique et le volume cellulaire avec une résolution subpicolitrique.

Une ingénierie cohérente des capteurs garantit le comptage de volumes d'échantillon égaux et la réalisation de mesures précises de taille. Une fois le capteur fixé, effectuez chaque étape du processus de comptage selon les instructions affichées à l'écran comme suit. Lorsque l'écran indique, maintenez enfoncé le piston pour commencer à appuyer sur le piston ; l'écran affichera ensuite « immergez le capteur », immergez le capteur dans la solution de suspension cellulaire, puis relâchez le piston pour aspirer la suspension cellulaire dans le capteur.

Le piston agit comme un signal électrique et aspire l'échantillon ainsi que le volume mort dans le capteur. La vitesse ou la précision du mouvement du piston n'est pas importante, contrairement au pipetage. Ce processus prendra plusieurs secondes lorsqu'il sera prêt.

L'appareil émettra un bip et l'échantillon chargé s'affichera sur l'écran. Une fois que l'échantillon est chargé dans le capteur, il est aspiré à travers la zone de détection pour évaluer la taille et le volume cellulaire. Ensuite, à travers les microcanaux, lorsque 50 microlitres d'échantillon ont été comptés, le capteur indique à l'appareil d'arrêter le comptage.

Une fois le comptage terminé, l'écran de l'instrument indiquera que le comptage est complet. Veuillez retirer le capteur et le jeter. Suivez l'invite à l'écran pour retirer et jeter le capteur.

L'appareil affichera ensuite un histogramme de la taille ou du diamètre des cellules sur son écran, ainsi que la concentration cellulaire par millilitre. Une fois le comptage terminé et l'histogramme affiché sur l'appareil, appliquez des fenêtres en appuyant sur le bouton bascule, sélectionnez le positionnement automatique des fenêtres (auto gating) ou utilisez la dernière option pour définir automatiquement la fenêtre en fonction du profil de l'histogramme ou pour reprendre les fenêtres du comptage précédent. Quel que soit le choix effectué, les fenêtres peuvent être déplacées manuellement afin d'ajuster précisément leur position.

Réglez les données, appuyez à nouveau sur le bouton bascule pour sélectionner la porte gauche et faites défiler le bouton pour déplacer la porte comme souhaité. Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton pour activer la porte droite et faites-le défiler pour positionner la porte droite. Cliquez à nouveau.

Une nouvelle concentration cellulaire, un volume cellulaire moyen et un diamètre seront affichés. L’interrupteur peut également être positionné d’un côté ou de l’autre pour basculer l’affichage entre la date et l’heure, la taille moyenne des cellules et le volume moyen des cellules. Jusqu’à 72 histogrammes peuvent être stockés directement sur l’appareil. Pour transférer les données vers un ordinateur personnel, connectez l’appareil via le port du câble USB, puis affichez l’écran sur l’ordinateur.

Double-cliquez sur l'application logicielle Scepter pour lancer le logiciel. Ensuite, cliquez sur « Connecter ». Tous les dénombrements seront automatiquement transférés vers le logiciel.

Le logiciel d'application scepter affiche l'histogramme détaillant la répartition de la population de la culture en fonction du volume ou du diamètre. Les fichiers téléchargés peuvent ensuite être exportés vers Microsoft Excel, où les données brutes seront affichées en classes de diamètres cellulaires ou de volumes cellulaires spécifiés. Dix-neuf lignées cellulaires différentes ont été préparées pour le comptage, et les concentrations initiales théoriques ont été déterminées à l'aide d'un compteur aculter.

Les suspensions cellulaires ont ensuite été davantage diluées afin d'obtenir des suspensions cellulaires à des concentrations cellulaires théoriques. Le compteur de cellules Scepter a ensuite été utilisé pour déterminer les concentrations cellulaires. Cette figure présente cinq dilutions mesurées pour cinq lignées cellulaires représentatives, ainsi que la concentration cellulaire théorique.

Le degré élevé de linéarité, indiqué par les valeurs de r², démontre que le comptage au scepter constitue une méthode fiable pour les lignées cellulaires testées, sur une large plage de fonctionnement linéaire. La précision relative globale du comptage au scepter est illustrée ici, où les données obtenues par comptage au scepter sont comparées aux chiffres obtenus par comptage au coter. Le logarithme des décomptes cellulaires au scepter est tracé en fonction du logarithme des décomptes au coter et montre que, pour l'ensemble des lignées cellulaires testées, les décomptes au scepter correspondent aux décomptes au coter.

Des dénombrements de 19 lignées cellulaires ont été réalisés à l’aide d’un compteur Coulter Z two. Le compteur cellulaire Scepter, un compteur automatisé basé sur la vision, tel que le système de comptage V cell ou le test count, ainsi que les dénombrements hemo TER, ont été effectués conformément aux instructions du fabricant, en utilisant la même suspension initiale de cellules et des dilutions identiques. Les résultats présentés dans cette figure démontrent que les concentrations cellulaires mesurées par comptage au Scepter correspondent étroitement aux concentrations cellulaires théoriques, avec une forte linéarité.

Le coefficient de variation en pourcentage, ou CV, a été calculé pour chaque dilution de chaque lignée cellulaire. Pour chaque système de comptage présenté ici, les coefficients de variation moyens en pourcentage sont indiqués sur l'ensemble de 19 lignées cellulaires, en fonction de la concentration cellulaire et de la méthode de comptage, dans la plage de fonctionnement. Le compteur de cellules Scepter est plus précis que le comptage au cytomètre hématique, affichant des écarts types plus faibles ainsi que des coefficients de variation moyens plus réduits.

Le comptage avec le Scepter est 10 fois plus rapide que l'hémocytométrie et plus rapide que d'autres compteurs automatisés également. Ici, les cellules SF nine, MCF seven et HC 2 93 ont été comptées à l'aide des méthodes décrites dans cette vidéo. Le temps moyen nécessaire pour mesurer la concentration cellulaire a été enregistré.

Remarquez que la cytométrie hématique a été effectuée une seule fois par échantillon. Le Scepter effectue des mesures basées sur la taille des cellules. Ainsi, tous les changements de morphologie cellulaire peuvent être capturés dans l'histogramme.

Les cultures saines présentent une belle distribution gaussienne en forme de cloche, tandis que les cellules non viables meurent et provoquent un décalage de l'histogramme vers la gauche. De même, lorsque l'on mélange une population composée de 50 % de cellules mortes avec 50 % de cellules vivantes, des décalages de l'histogramme sont également observés. Je viens de vous montrer comment utiliser le nouveau compteur de cellules Scepter de Millipore, qui révolutionne la manière dont les chercheurs comptent leurs cellules.