Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser des outils d’analyse numériques pour effectuer rapidement des comptages précis de cellules en suspension ou en migration dans une membrane de test d’invasion. Ce protocole peut aider les chercheurs à quantifier le nombre de cellules requis pour les techniques courantes et les tests de motilité cellulaire in vitro. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet un comptage rapide et précis des cellules tout en incluant plusieurs filtres et outils d’analyse.

Pour commencer, réglez l’éclairage du microscope au maximum. Passez à l’objectif 4x et assurez-vous que les filtres à contraste de phase sont utilisés. Ensuite, dans le logiciel du microscope, réglez les paramètres de capture d’image sur leurs valeurs par défaut.

Placez maintenant un hémocytomètre standard sur la platine du microscope et capturez une image pour l’étape d’étalonnage du volume d’image. Ajustez le temps d’exposition au besoin. Dans ImageJ, sous le calculateur de concentration de cellules, ouvrez l’image et cliquez sur le bouton Obtenir la dimension de l’image.

Cette action remplit les zones de texte largeur et hauteur de l’image avec la résolution de l’image en pixels. Ensuite, sélectionnez l’outil Ligne droite et tracez une ligne droite sur toute la longueur du carré p primaire de l’hémocytomètre en cliquant et en faisant glisser le curseur. Appuyez ensuite sur la touche M pour afficher la fenêtre des résultats.

Maintenant, tapez la valeur de la colonne longueur dans la zone de texte longueur p carré de la calculatrice de concentration de cellule. Ensuite, cliquez sur le bouton Calculer le volume de l’image pour afficher le volume de l’image dans la zone de texte du volume de l’image. Enfin, cliquez sur le bouton Enregistrer pour terminer l’étalonnage du plugin.

Pour l’analyse d’échantillons, chargez 10 microlitres de cellules dans les deux chambres d’une lame d’hémocytomètre et ajustez la mise au point de sorte que l’intérieur des cellules soit plus foncé que la membrane cellulaire pour fournir une mise au point dans la section transversale centrale de la cellule et non aux pôles. Ensuite, ajustez davantage l’exposition afin que les cellules ne soient pas surexposées. Des lignes d’hémocytomètre légèrement visibles sont acceptables.

Maintenant, capturez cinq à dix images non superposées de la région centrale de l’hémocytomètre. La résolution et l’agrandissement de chaque image doivent être les mêmes que pour l’image d’étalonnage du volume. Ensuite, dans le calculateur de concentration de cellules, cliquez sur Compter les cellules et dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez un dossier à compter.

Ensuite, dans la zone de saisie du numéro d’échantillon, entrez le nombre d’images prises par chambre, puis cliquez sur OK. Le plugin va maintenant collecter les données. Voir le texte pour plus de détails. Pour commencer, dans le logiciel du microscope, réglez les paramètres de capture d’image sur leurs valeurs par défaut.

Pour l’étage de la lunette de dissection, utilisez un fond blanc uni et utilisez une source lumineuse au-dessus de la scène, de préférence deux lumières LED flexibles. Maintenant, placez une diapositive de membrane de test de migration terminée sur la scène. En regardant l’image en temps réel affichée par le logiciel, ajustez manuellement le grossissement de sorte que les bords d’une seule membrane se trouvent juste dans le champ de vision de la caméra.

Ensuite, ajustez les positions des sources lumineuses et les temps d’exposition pour reproduire, le plus fidèlement possible, l’image idéale. Qui a une couleur de fond minimale et une membrane uniformément éclairée. La précision du comptage des cellules dépend de l’acquisition d’images de haute qualité.

Il est donc important de capturer la meilleure image possible réalisée par l’appareil photo de l’utilisateur pour l’utilisation la plus efficace des plugins. Maintenant, retirez la lame et balancez les blancs de l’image dans le logiciel du microscope pour terminer l’étalonnage. Immédiatement avant l’imagerie, aplatissez chaque membrane en appliquant une pression sur la lamelle de recouvrement pour éliminer autant de bulles piégées que possible.

Maintenant, dans le logiciel, définissez l’emplacement du dossier de capture. Ensuite, capturez une image par membrane, en enregistrant les fichiers d’image en tant que TIF à l’aide de la convention de dénomination de l’échantillon 001 avec des augmentations incrémentielles du nombre pour chaque image. Cette convention de nommage est nécessaire pour que le plugin puisse trouver les fichiers.

Si vous souhaitez corriger le champ plat, recherchez une zone vide pour chaque diapositive et prenez une image vierge. Enregistrez le fichier sous le nom d’échantillon vide. Ensuite, dans ImageJ, ouvrez le plugin TC.

Dans TC, cliquez sur le bouton Flatfield et, dans la boîte de dialogue Choisir un répertoire, sélectionnez le dossier dans lequel les images de la membrane ont été enregistrées. Maintenant, ouvrez une image de membrane de test de migration et sélectionnez Seuil de couleur. Dans la fenêtre, définissez la méthode sur Shanbhag.

Réglez la couleur du seuil sur blanc. Réglez l’espace colorimétrique sur RVB et décochez l’option d’arrière-plan sombre. Ensuite, ajustez les curseurs supérieurs à zéro et les curseurs inférieurs à 255 pour rendre l’image entièrement blanche.

Une fois blanc, ajustez les curseurs vert et rouge jusqu’à ce que seuls les noyaux soient visibles. Dans le plugin TC, copiez les valeurs des curseurs RVB dans les zones de texte des paramètres de configuration associés au seuil RVB. Ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter/Modifier et écrasez la configuration.

Dans le panneau des paramètres de configuration, cliquez sur Enregistrer pour écrire les paramètres sur le disque dur. Maintenant, pour compter les images avec le plugin TC, cliquez sur Compter le dossier et sélectionnez le dossier à compter. Le programme traitera ensuite les images et ajoutera automatiquement les données à la table principale.

Maintenant, dans le tableau principal, il y aura une coche dans la section Calibrer ? La colonne si dans l’image est marquée pour étalonnage en fonction de sa ressemblance avec les mesures idéales. Sélectionnez tous les échantillons marqués pour l’étalonnage.

Ensuite, faites un clic droit et sélectionnez Recompter et Taille suggérée. Cela comptera les images avec la zone minimale de particules suggérée. Ensuite, cliquez à nouveau avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Afficher le tracé.

Une image idéale aura un graphique ressemblant à une longue distribution normale à droite. Si nécessaire, ajustez la plage de taille inférieure ou les paramètres de seuil RVB en sélectionnant l’échantillon, en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Recompter et Paramètres manuels. Ensuite, entrez les paramètres souhaités et cliquez sur Compter pour recompter l’image.

Pour ajuster les comptages manuellement, sélectionnez les échantillons, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la table, puis sélectionnez Ouvrir l’image avec les comptes. L’image d’origine s’ouvrira avec des marques rouges qui représentent chaque particule comptée par le plugin. De plus, l’option Afficher l’image binaire comptée peut être utilisée pour vérifier la qualité de la résolution des cellules individuelles par le seuillage des couleurs.

Pour ajouter manuellement un compte, maintenez la touche Ctrl enfoncée et cliquez avec le bouton gauche. Cela ajoutera un marqueur à l’emplacement du curseur qui sera ajouté au décompte total. Pour supprimer manuellement un marqueur, faites un clic droit sur l’image et le plugin supprimera le marqueur le plus proche du curseur.

Pour supprimer un groupe de marqueurs, sélectionnez une région d’intérêt et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la région tout en maintenant la touche Ctrl enfoncée. Le processus du calculateur de concentration cellulaire dépend de l’image d’étalonnage du carré p et du calcul de la longueur et des pixels du carré p. Le p-carré d’un hémocytomètre a un volume de 100 nanolitres, et compte tenu de cette constante, le volume total de l’image peut être calculé après conversion des pixels en millimètres.

Une comparaison des comptages manuels et automatisés sur 57 images provenant de diverses expériences et de différents types de cellules montre qu’il existe une corrélation très étroite entre les deux méthodes. Des concentrations comprises entre cinq millions et 2 000 cellules par millilitre ont été comptées avec précision à l’aide du processus automatisé. La métrique Q représente la clarté globale des images basée sur la distribution de tailles de particules distinctes.

Un Q adéquat est supérieur à 0,5. En appliquant ces qualificatifs à une sélection d’images modestes à excellentes en ce qui concerne la luminosité et le bruit de fond, le nombre d’images calibrées était nettement plus proche du comptage manuel que le nombre d’images non calibrées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de compter avec précision et efficacité les cellules en suspension et à partir de tests de motilité cellulaire à l’aide des plugins CCC et TC ImageJ.

Une fois le plugin TC maîtrisé, dans lequel l’acquisition, la quantification et l’ajustement du nombre de cellules peuvent être effectués en moins d’une heure. Les deux plugins s’appuient sur la fonction de comptage de particules d’ImageJ et peuvent être modifiés en modifiant les macros utilisées par ImageJ. Cela offre une plus grande flexibilité à l’utilisateur pour étendre la portée des plugins à d’autres particules.