Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une expérience de puces à ARN micro. Cela est accompli en premier lieu en obtenant des lames de puces à ADN imprimées contenant une bibliothèque de sondes d'ARN micro, puis en préparant des échantillons d'ARN de qualité et de quantité appropriées. Ensuite, l'ARN et un échantillon d'ADN contrôlé sont marqués avec des colorants fluorescents.

Ensuite, les acides nucléiques marqués sont ajoutés à une lame de puces à ADN pour l'hybridation. Enfin, la lame de puces à ADN est lavée, analysée et régénérée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'expression à l'échelle du génome des microARN par l'analyse de la lame en fonction des intensités d'hybridation des sondes individuelles de microARN.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'expression génique, telles que la manière dont les conditions physiologiques normales ou les conditions pathologiques affectent différemment les besoins en expression micro à une échelle globale. La qualité de la fabrication des puces à ADN est l'un des facteurs les plus critiques pour la réussite d'une expérience de puces à ADN. Après avoir isolé l'ARN en utilisant une méthode qui préserve les petits ARN et l'avoir resuspendu à une concentration égale ou supérieure à deux milligrammes par millilitre, marquer l'ARN dans un volume réactionnel de 20 microlitres en mélangeant d'abord environ 25 microgrammes d'ARN total avec 0,5 microgramme de cinq prime P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime dans un tampon HEPs 1X enrichi en T four RNA Ligase 1D TT et en TP. Si moins d'ARN est disponible, réduire proportionnellement la quantité d'ARN et celle de la réaction.

Si l'ARN est très dilué, ajouter un porteur tel que de la levure ou de l'ARNt pour faciliter la précipitation, puis incuber la réaction sur de la glace à l'intérieur d'un réfrigérateur pendant deux à 24 heures. Ensuite, ajouter de l'acétate de sodium à une concentration finale de 0,3 molaire, puis trois volumes d'éthanol, et précipiter l'ARN toute la nuit à moins 20 degrés Celsius. Pour utiliser les lames pour la première fois, les pré-hybrider dans une solution filtrée de 3 XSSC, 0,1 % de SDS et 0,2 % d'albumine sérique bovine (BSA) pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, plonger les lames dans l'eau plusieurs fois. Puis, à l'isopropanol, sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse équipée d'un adaptateur pour lames à 100 ×g pendant cinq minutes à 22 °C. Rincer les bandes de soulèvement dans l'eau.

Ensuite, dans l'éthanol avant séchage à l'air, placez une lame à l'intérieur de la base d'une chambre d'hybridation pour puces à ADN et un couvre-objet soulevable par-dessus la lame de manière à ce que le couvre-objet soulevable recouvre la zone de la sonde et ses bandes blanches. Mettez en contact la lame à l'abri de la lumière, centrifugez pour ramener au fond l'ARN marqué précipité, lavez-le une fois avec de l'éthanol à 70 % et séchez le culot à l'air. Le culot doit présenter une couleur rougeâtre.

Préparez une solution d'hybridation en utilisant un volume compris entre un quinzième et un centième de l'ADN témoin marqué purifié par échantillon d'ARN. Dissolvez complètement le culot d'ARN avec environ 60 microlitres de la solution d'hybridation afin de garantir que la solution d'hybridation ne s'assèche pas. Pendant l'incubation, ajoutez 20 microlitres d'eau dans chacun des puits humidifiants, situés à la base de la chambre d'hybridation pour puces à ADN.

Ajouter le mélange d'ARN marqué et d'ADN de référence sur la lame. À l'aide d'une pipette fine, toucher doucement le bord du calespacer et, par capillarité, laisser la solution pénétrer dans l'espace entre le calespacer et la lame.

Placer le couvercle de la chambre d'hybridation sur la base. Ensuite, sceller la chambre avec des pinces métalliques. Placer l'ensemble de la chambre à l'intérieur du sac en plastique fourni avec la cassette de chambre.

Enfin, placez la cassette de chambre dans un récipient contenant une serviette en papier humide. Recouvrez ensuite le récipient d'un film plastique et placez-le dans une étuve à culture cellulaire humide à 37 degrés Celsius pendant environ 24 heures. Pour traiter les lames après hybridation, démontez les cassettes de chambre une par une, immergez une lame ainsi que sa plaque de levage dans du XSSC 2 à 22 degrés Celsius.

Le glissement du lifter tombera naturellement de la lame. Laver les lames deux fois dans du XSSC 0,8, puis trois fois dans du XSSC 0,4, pour une durée totale d'une à deux minutes. Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse équipée d'un adaptateur pour lames. Ensuite, analyser les lames à l'aide d'un scanner de puces à ADN et utiliser un programme tel que Blue Fuse pour quantifier les intensités dans les fichiers d'image.

Inspectez les taches individuelles afin d'exclure les taches anormales, qui proviennent généralement de l'impression des lames à puits ou de la manipulation des lames après hybridation. Pour l'analyse et la présentation des données, utilisez des programmes tels que Gene Spring et Excel afin de réutiliser la matrice de puces à ADN. Décapez la lame en la rinçant à l'eau, puis en la plongeant dans une boîte de coloration contenant une solution préchauffée de une millimolaire de NaOH et de 0,1 X SSC à 62 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.

Répétez l'incubation une deuxième fois. Lavez les lames plusieurs fois dans de l'eau pendant jusqu'à 60 minutes avec agitation douce à 22 degrés Celsius. Séchez les lames à l'aide d'une centrifugeuse et stockez-les à 22 degrés Celsius.

Les lames peuvent être utilisées sans pré-hybridation. Cette figure montre une image numérisée d'une puces à ADN démontrant des signaux d'hybridation très précis et intenses. Les taches rouges résultent de l'hybridation de l'ADN témoin, les taches vertes de l'échantillon d'ARN marqué avec DY 5 47, et les taches jaunes proviennent de l'hybridation à la même sonde à la fois de l'ADN et de l'ARN.

Les coefficients de corrélation de Pearson entre les réplicats techniques d'hybridation sur puces à ADN sont d'environ 0,99, ce qui indique une excellente reproductibilité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une expérience personnalisée sur puces à ADN, non seulement pour quantifier les micronases, mais aussi pour quantifier d'autres types d'acides nucléiques tels que les ARNm.