Western Blot: préparation d'échantillons à la détection

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la facilité d'exécution d'un immunotransfert (Western blot) lorsqu'on utilise des produits adaptés. Après la préparation des échantillons, les protéines sont séparées selon leur taille, puis transférées sur une phase solide. Les protéines sont ensuite révélées à l'aide d'anticorps, et leur détection, réalisée selon des protocoles appropriés et à l'aide de réactifs de haute qualité et économiques, permet d'obtenir des résultats améliorés en immunotransfert.

Bonjour, je suis Jesse Luhan, scientifique en recherche et développement chez EMD Chemicals à San Diego, en Californie. EMD est une filiale de Merck KGaA à Darmstadt, en Allemagne. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de western blot.

Commençons. La première étape du western blot consiste à préparer les échantillons. Commencez par la préparation des échantillons en centrifugeant les cellules à faible vitesse, par exemple cinq minutes à 2 500 ×g.

Après centrifugation, éliminer le surnageant des culots cellulaires. Bien resuspendre les cellules dans le réactif d'extraction protéique Cyto buster en utilisant 150 microlitres par 106 cellules. Incuber l'échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à 16 000 ×g et à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Transférer le surnageant clarifié dans un tube neuf et procéder à l'analyse. Une fois la concentration en protéines de l'échantillon déterminée, préparer l'échantillon pour le chargement sur gel afin de dénaturer les protéines.

Utilisez un tampon d'échantillonnage contenant un détergent dénaturant anionique tel que le dodécylsulfate de sodium ou SDS. Portez une ébullition le mélange à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l'aide d'un gel préfabriqué disponible dans le commerce, les protéines peuvent être séparées rapidement selon leur masse moléculaire.

Remplissez l'appareil d'électrophorèse avec du tampon de migration, qui peut être préparé à partir des réactifs proposés dans la gamme chimique Omni PU. Chargez la première lame du puits avec le marqueur protéique trail mix. Ce marqueur comporte trois bandes de référence permettant un suivi pendant l'électrophorèse.

Une fois le gel coloré, 10 bandes sont visibles, allant de 10 à 225 kilodaltons. Chargez l'échantillon dénaturé dans les puits restants. Faites migrer le gel à 220 volts pendant une heure.

Une fois que les protéines se sont séparées, colorer le gel avec du bleu kumasi afin de s'assurer que les protéines ont migré de manière uniforme et régulière, en utilisant une coloration rapide et ultrasensible, prête à l'emploi, sans qu'une coloration DS soit nécessaire. De même que les protéines chargées électriquement peuvent être induites à migrer à travers un gel sous l'effet d'un champ électrique, elles peuvent être transférées, sous l'effet d'un champ électrique, du gel vers une membrane telle que la nitrocellulose ou le PVDF. Lors de l'utilisation de membranes en PVDF, les imbiber dans du méthanol pendant quelques minutes, puis les équilibrer dans du tampon de transfert glacé pendant cinq minutes. Imbiber également le gel pendant quelques minutes dans du tampon de transfert glacé ; cette étape d'équilibrage empêche le rétrécissement du gel pendant le transfert.

Pour un transfert humide, assemblez un sandwich composé du gel et de la membrane entre une éponge et du papier. Ensuite, serrez fermement l'ensemble après vous être assuré qu'aucune bulle d'air ne s'est formée entre le gel et la membrane. Plongez le sandwich dans du tampon de transfert et appliquez un champ électrique.

Les protéines chargées négativement migrent vers l'électrode chargée positivement. La membrane les arrête ensuite, les fixe et les empêche de progresser davantage. Une fois le transfert terminé, visualisez les protéines afin de vérifier un transfert uniforme, sans poches d'air.

Cela peut facilement être réalisé avec le colorant rouge d'alerte pour immunoblot. Ce colorant est prêt à l'emploi et la décoloration peut être effectuée facilement à l'eau. Il s'agit du gel une fois qu'il a été décoloré par lavage à l'eau. Avant que la membrane ne soit révélée par un anticorps, celle-ci est bloquée.

Pour éviter la liaison non spécifique, bloquez la membrane avec des réactifs de blocage de haute qualité. Pour prévenir un fond élevé, incubez-la dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante sous agitation douce, puis lavez la membrane trois fois dans du TBST ou du PBST après l'incubation. Ces tampons peuvent être préparés facilement et commodément à l'aide respectivement de comprimés TBS tween et de comprimés PBS tween.

Une fois que la membrane a été bloquée et lavée, elle peut être incubée avec l'anticorps primaire. Appliquez l'anticorps primaire à l'aide de la solution, l'un des amplificateurs de signal, ce qui permet d'amplifier considérablement le signal. Préparez l'anticorps primaire dans la solution un et incubez la membrane pendant une heure.

Il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres agents de blocage après l'incubation. Lavez la membrane avec du TBST. Ensuite, incubez la membrane avec l'anticorps secondaire dilué dans la solution deux du signal boost pendant une heure.

Enfin, lavez à nouveau la membrane plusieurs fois avec du TBST pour la détection des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (HRP) par chimiluminescence améliorée ou ECL, méthode traditionnellement utilisée ici. L'étape rapide du réactif ECL est employée car elle ne nécessite aucun mélange de luminol ou d'agent amplificateur.

Il suffit de pulvériser la membrane plusieurs fois, de l'incuber pendant deux minutes, puis de la révéler à l'aide d'un film radiographique. Rapid Step offre une sensibilité de l'ordre du pictogramme ainsi qu'une émission lumineuse durable jusqu'à deux heures après l'ajout du substrat. Les marqueurs protéiques Trail mix permettent le suivi des protéines durant l'électrophorèse, par comparaison avec les protocoles standards de transfert Western blot.

Signal Boost permet une gamme dynamique et une sensibilité accrues. Enfin, une sensibilité supérieure peut être obtenue en utilisant le réactif Rapid au lieu des réactifs ECL traditionnels. Nous venons de vous montrer comment réaliser un immunoblotting de manière efficace et économique à l'aide d'une gamme complète de produits.

N'oubliez pas que la qualité de vos résultats dépend de la qualité de vos réactifs. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.