Cellules souches: le contrôle qualité des échantillons, hybridation Array et balayage

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une expérience de puces à ADN à l'aide d'un appareil mélangeur automatisé. Cela est réalisé en analysant d'abord la qualité des échantillons d'ARN à l'aide du bioanalyseur, après amplification et marquage de l'ARN. Les échantillons d'ARN sont hybridés aux puces à ADN.

Enfin, les puces à ADN hybridées sont lavées et analysées par lecture. En définitive, les résultats obtenus montrent l'expression différentielle des transcrits d'ARN grâce à l'analyse d'images de puces à fluorescence double couleur. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'hybridation sur puces sont difficiles à apprendre en raison de l'utilisation d'équipements spécialisés.

L'analyse de contrôle qualité commence par la préparation de l'instrument bioanalyzer 2, 100 et de la station de amorçage de la puce, comme indiqué dans la procédure écrite. La matrice de gel est ensuite filtrée en pipetant 550 microlitres dans un filtre centrifuge fourni avec le kit RNA 6,000 nano. La centrifugation s'effectue à 1 500 RCF pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, aliquoter le gel filtré en prélèvements de 65 microlitres, qui peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum. Vortexer le concentré de colorant pendant 10 secondes et ajouter un microlitre à un prélèvement de 65 microlitres. Après vortexage du mélange, centrifuger le gel filtré à 13 000 RCF pendant 10 minutes à température ambiante afin de courir les échantillons.

Placez d'abord une puce sur la station d'amorçage. Dans cette démonstration, des puces RNA 6,000 nano sont utilisées. Chargez neuf microlitres du mélange de gélatine et de colorant dans le puits marqué d'un G blanc sur fond noir.

Avec la pointe de pipette positionnée tout en bas du puits, placez le piston de la seringue à un millilitre et fermez la station de amorçage. Appuyez lentement mais régulièrement sur le piston jusqu'à ce qu'il soit maintenu par le clip.

Après 30 secondes, relâchez le clip et laissez le piston remonter pendant quelques secondes. Une fois le piston arrêté, ramenez-le à la position d'un millilitre et ouvrez la station d'amorçage. Chargez neuf microlitres du colorant pour gel.

Mélanger dans chacun des deux puits. Marquer G. Ensuite, déposer cinq microlitres du marqueur dans le puit témoin et dans chacun des 12 puits d'échantillons. Charger ensuite un microlitre du témoin dénaturé dans le puit témoin et un microlitre de chaque échantillon dénaturé dans les puits d'échantillons.

Enfin, ajoutez un microlitre du marqueur dans chaque échantillon inutilisé. Une fois les puits chargés, vortexer la puce pendant une minute à 2 400 tr/min. Après avoir démarré le logiciel 2 100 expert, positionnez la puce et fermez le couvercle.

Vérifiez que le bon port est sélectionné et exécutez le test dans les cinq minutes suivant le chargement des échantillons afin d'éviter l'évaporation. Les méthodes de réalisation de l'amplification et de l'étiquetage de l'ARN peuvent être consultées dans le protocole écrit. Une fois marqué, purifiez l'ARNc pour éliminer les nucléotides non incorporés. À l'aide de colonnettes miniatures Cogens, l'ARNc marqué peut ensuite être quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000.

En mode de mesure par puces à ADN, enregistrez la concentration de l'échantillon, le rendement et l'activité spécifique. Pour l'hybridation sur puce à ADN, il est nécessaire d'obtenir un rendement d'au moins 825 nanogrammes et une activité spécifique d'au moins huit picomoles par microgramme au moins deux heures avant l'hybridation sur puce à ADN. Allumez la station d'hybridation et réglez-la à 65 degrés Celsius.

Ce protocole décrit l'utilisation de puces Agilent quatre par 40 4K avec le système d'hybridation Roche nimble gen et une chambre de mélange quadruple après la fragmentation de l'ARNc réalisée comme décrite dans le protocole écrit, préparer la chambre d'hybridation. Placer une lame de puces dans l'outil d'assemblage et de désassemblage, côté code-barres. Ouvrir d'abord un mélangeur A et exposer l'adhésif maintenant la puce et l'outil d'assemblage et de désassemblage afin d'éviter tout déplacement.

Placer le mélangeur A four sur la lame en partant de l'extrémité opposée. S'assurer qu'il est correctement aligné par rapport à l'outil et fixer le mélangeur le long de la matrice. Faire glisser à partir de l'extrémité du mélangeur pour retirer l'ensemble lame-mélangeur.

À l’aide de l’outil de lissage, appuyez fermement tout le long du joint adhésif afin de garantir qu’il soit bien collé à la lame. De petites bulles d’air piégées entre l’adhésif et la lame peuvent être visibles sur fond sombre. Prenez le temps nécessaire pour éliminer ces bulles à l’aide de l’outil de lissage.

Le réseau est désormais prêt à être chargé. Utilisez une pipette à déplacement positif pour charger 100 microlitres de l'échantillon d'hybridation. Insérez fermement la pointe à l'intérieur du hublot et délivrez lentement et régulièrement afin qu'aucun air ne soit piégé dans la zone du réseau.

Lorsque l'échantillon recouvre entièrement la matrice et que le liquide commence à sortir rapidement par le port de ventilation, retirez uniquement le piston de la pipette. Une fois que l'embout est éloigné de la lame, tamponnez délicatement l'excès de liquide aux deux ports, en prenant soin de ne pas extraire l'échantillon de la chambre elle-même. Ensuite, couvrez les orifices avec des autocollants à l'aide de pinces.

Placer la lame sur la station d'hybridation et vérifier que les trous des vessies sont correctement positionnés au-dessus des joints toriques. Cela garantira un mélange adéquat pendant l'hybridation. Fermer le couvercle de la lame et le couvercle de la station.

Régler la station sur le mode de mélange B et hybrider la matrice à 65 degrés Celsius pendant 17 heures. Une fois terminé, remplir un plat en verre étiqueté A avec le tampon de lavage un ; le plat doit être suffisamment grand pour accueillir l'outil d'assemblage et de désassemblage, tout en permettant une certaine manœuvrabilité. Tous les lavages doivent être effectués dans du matériel en verre, car le plastique a tendance à libérer des composés, ce qui entraîne un fond élevé sur la matrice.

Placer un porte-lame et une barre d'agitation dans une boîte de coloration. Intitulée B, remplir la boîte avec du tampon de lavage en quantité suffisante pour recouvrir le porte-lame, puis placer la boîte sur un agitateur magnétique à température ambiante. Ajouter également une barre d'agitation dans une boîte de coloration vide intitulée C et la placer sur un agitateur magnétique.

Retirez la matrice du poste d'hybridation et placez-la dans l'outil de montage et démontage. Plongez l'ensemble dans la boîte tout en tenant l'outil de montage et démontage d'un côté et la lame de l'autre côté avec une seule main. Détachez soigneusement le mélangeur A quatre en prenant garde de ne pas rayer la zone de la matrice.

Placez rapidement la lame sur le porte-lame et dans la cuve de coloration B. L'exposition à l'air doit être minimisée, car le colorant SCI five est sensible à l'ozone. Lavez l'effacement pendant une minute en agitant à vitesse moyenne. Remplissez la cuve de coloration C avec le tampon de lavage 2 préchauffé.

Transférez les lames et rincez pendant une minute. Après le rinçage, retirez très lentement le porte-lames de la coupelle de coloration C afin de minimiser les gouttelettes restant sur la lame. Séchez la lame par centrifugation pendant deux minutes.

Ensuite, placer la lame dans un tube conique de 50 millilitres et remplir immédiatement avec du gaz argon en effectuant une analyse à l’aide du scanner GenePix 4 000 B de Molecular Devices afin d’éviter la perte de signal observée. Voici des exemples de quatre échantillons d’ARN isolés à partir de cerveau humain. La qualité des échantillons de tissu tumoral a été évaluée à l’aide du Bioanalyzer 2 100 sur une puce RNA 6 000.

Les flèches pleines et ouvertes indiquent respectivement la position des espèces d'ARN 18 S et 28 S. Le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) est une mesure quantitative de la qualité de l'ARN ; des échantillons d'ARN total de bonne qualité doivent produire uniquement deux pics majeurs lorsqu'ils sont analysés sur un bioanalyseur pour le contrôle qualité, correspondant aux deux principales espèces d'ARN ribosomiques.

Une certaine dégradation de l'ARN apparaîtra sous forme d'une traînée avant le premier pic d'ARN ribosomique et d'un pic nettement plus bas pour l'ARN 28 S-R-R-N-A fortement dégradé. Un ARN de mauvaise qualité présentera un pic large ou une série de pics à de faibles temps de rétention. Dans ce cas, les deux pics d'ARN ribosomique seront d'une intensité très faible ou pas identifiables du tout.

Des puces de bonne qualité doivent produire un signal élevé à des valeurs relativement faibles du PMT. On s'attend à ce que la plupart des transcrits soient présents à des niveaux similaires dans l'échantillon expérimental et l'échantillon de référence. Des changements massifs et généralisés de l'expression génique manqueront probablement de signification biologique.

Par conséquent, la majeure partie de la matrice devrait apparaître en jaune plutôt qu'en vert ou en rouge. Les signaux de bonne qualité doivent également se situer dans une plage dynamique telle que les histogrammes de signal se superposent entièrement, comme observé sur le nuage de points de l'image de la matrice. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une expérience de puces à ADN en utilisant un appareil d'hybridation automatisé.