Haut débit écran surexpression plasmide de levure

L'objectif général de cette procédure est de transformer des cellules de levure avec une bibliothèque matricielle d'ADN plasmidiques. Cette étape est réalisée en cultivant d'abord une quantité appropriée de cellules de levure. Les cellules de levure sont ensuite traitées avec de l'acétate de lithium afin de les rendre compétentes pour la transformation par de l'ADN.

Ensuite, transformez les cellules compétentes e en les mélangeant avec de l'ADN. La dernière étape de la procédure consiste à sélectionner et analyser les transformants. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les effets de l'ADN plasmidique sur les phénotypes de levure grâce à des tests de dépôt sur boîte (yeast spotting assays) et/ou à la microscopie.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux protocoles existants, tels que les transformations standard de levures, est qu'elle permet la transformation d'un grand nombre de plasmides différents dans des cellules de levure de manière automatisée. Ce protocole de transformation de levure à haut débit est conçu pour 10 plaques de 96 puits, mais peut être adapté en fonction des besoins. Pour les expériences à plus grande échelle, la clé du succès consiste à maintenir une organisation rigoureuse de toutes les plaques et des réactifs.

Une fois l'expérience commencée, afin d'éviter toute confusion, un distributeur automatique de plaques liquides Biobot sera utilisé dans ce protocole. Pour commencer, aliquoter de cinq à dix microlitres d'ADN plasmatique provenant d'une bibliothèque de plasmides de levure dans chaque puits de plaques rondes à fond plat de 96 puits. Placer les plaques de 96 puits, découvertes, à l'intérieur d'une hotte de sécurité propre pendant toute la nuit pour les faire sécher.

Ensuite, ensemencer 200 millilitres de milieu YPD (extrait de levure, peptone, dextrose) avec une souche d'intérêt dans un flacon Lin Meyer baflé de 500 millilitres et incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation. Le lendemain matin, diluer la souche d'intérêt jusqu'à une DO 600 de 0,1 dans deux litres de milieu YPD pour une croissance optimale. Faire croître des cultures d'un litre maximum dans des flacons baflés séparés de 2,8 litres.

Agiter les flacons pendant quatre à six heures à 30 degrés Celsius jusqu'à ce que les cultures atteignent une DO 600 de 0,8 à 1,0. Lorsque la culture de levure a atteint une DO 600 de 0,8 à 1,0, récolter les cellules par centrifugation. Remplir quatre tubes coniques jetables de 225 millilitres avec la culture, et centrifuger à 3000 tr/min pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de table.

Versez le surnageant S hors de chaque tube. Ajoutez davantage de milieu de culture dans les mêmes tubes et centrifugez à nouveau, en répétant selon les besoins jusqu’à ce que toutes les cellules soient récupérées. Lavez chaque culot cellulaire avec 50 millilitres d’eau distillée stérilisée par autoclavage et reprenez en vortexant.

Combiner les cellules dans un tube conique de 225 millilitres et centrifuger à 3000 tr/min pendant cinq minutes. Après élimination du surnageant S, laver les cellules dans 100 millilitres de solution d'acétate de lithium. Centrifuger à nouveau à 3000 tr/min pendant cinq minutes.

Retirez le SNA et resuspendez le culot cellulaire dans 70 millilitres de solution d'acétate de lithium. Vortexez à grande vitesse pendant environ 30 secondes jusqu'à ce que le culot soit complètement resuspendu. Incubez sous agitation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez du bêta-méthylcépéroxyéthanol à 0,1 molaire et incubez sous agitation à 30 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Après l'incubation de 30 minutes, ajoutez deux millilitres d'ADN de sperme de saumon bouilli et refroidi au mélange cellulaire. Versez le mélange cellulaire dans une plaque monocuvette stérilisable, puis éliminez tout précipité qui se forme, car cela pourrait interférer avec les pipetages ultérieurs.

À l’aide du biobot, prélever rapidement 50 microlitres du mélange cellulaire dans chaque puits des quatre plaques de 96 puits préparées précédemment contenant l’ADN plasmatique. Ne pas mélanger. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 minutes sans agitation, pendant que les cellules sont en incubation.

Préparez 200 millilitres de solution de PEG DMSO acétate de lithium. Mélangez 160 millilitres de PEG 33 à 50 %, 20 millilitres de DMSO et 20 millilitres d'acétate de lithium à une molaire. Il est important que cette solution soit préparée juste avant utilisation.

Ajouter 125 microlitres de solution de PEG, acétate de lithium et DMSO à chacun. Bien mélanger en aspirant et en dispensant la suspension cellulaire huit fois. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes sans agitation.

Ensuite, soumettez les cellules à un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un incubateur sec. N’empilez pas les plaques après le choc thermique. Faites tourner les plaques à l’aide d’adaptateurs de centrifugeuse adaptés aux plaques de 96 puits. Après la centrifugation, retirez la solution de PEG en retournant les plaques au-dessus d’un récipient pour déchets. Essuyez ensuite les plaques retournées sur du papier absorbant.

Pour éliminer le liquide résiduel, les cellules resteront au fond des puits. Rincer les cellules en ajoutant 200 microlitres de milieu minimal à chacun. Faire à nouveau tourner les plaques dans une centrifugeuse.

Éliminer le surnageant en retournant la plaque au-dessus d’un récipient à déchets et en tamponnant avec du papier absorbant. Ajouter 200 microlitres de milieu minimal dans chaque puits avec une plaque rapide, puis incuber à 30 degrés Celsius pendant deux jours sans agitation. Après deux jours, de petites colonies de cellules devraient commencer à se former au fond de chaque puits ayant été correctement transformé.

Pour préparer le test de Spatting, commencez par distribuer 200 microlitres de milieu minimal à base d'OSE dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits à fond plat. Ensuite, mélangez chaque puits de la plaque de transformation en aspirant et en redistribuant la suspension cellulaire huit fois à l’aide d’une plaque rapide.

Inoculez chaque puits de la plaque contenant du raffinose avec cinq microlitres de mélange cellulaire provenant de la plaque de transformation, puis incubez à 30 degrés Celsius pendant un jour. Le jour suivant, de petites colonies doivent être présentes au fond de chaque puits.

Nous réalisons le test de dépôt dans une hotte, en stérilisant un bloc de 96, un réplicateur ou un « frogger » par flamboiement. Mélangez les colonies à l’aide du frogger, puis déposez les colonies sur des boîtes de milieu sélectif. Après le dépôt, laissez les boîtes sécher dans la hotte pendant cinq à dix minutes.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Des résultats représentatifs d'un écran d'hyperexpression de plasmide chez la levure visant à identifier des suppresseurs et des amplificateurs de la toxicité de TDP-43 sont présentés ici. TDP-43 est une protéine humaine impliquée dans la pathogenèse de la sclérose latérale amyotrophique, ou maladie de Lou Gehrig. L'expression de TDP-43 dans les cellules de levure entraîne une agrégation et une cytotoxicité.

Ces plaques présentent des colonies contenant un plasmide TDP43 sous contrôle d’un promoteur inductible par le galactose, et qui ont également été transformées avec des plasmides provenant de la bibliothèque d’expression ORF de la collection flex gene. Les colonies apparaissent ici de couleur rouge car la souche possède une mutation conduisant à l’accumulation d’un pigment rouge. La plaque située à gauche contient du glucose, qui réprime l’expression du plasmide TDP43 ou des plasmides de la collection flex gene.

La plaque de droite contient du galactose, qui induit l'expression de TDP 43 et des O Fs dans les plasmides du gène flex. La flèche verte indique une colonie transformée avec un plasmide qui supprime la toxicité de TDP 43, comme en témoignent une croissance plus rapide et des colonies plus denses. La flèche rouge indique une colonie transformée avec un plasmide qui augmente la toxicité de TDP 43, comme le montre une croissance plus lente et des colonies moins denses.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transformer une bibliothèque d'ADN plasmatique évitant les cellules.