Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo

Un des défis de l'étude du développement en neurosciences consiste à capturer les morphologies dendritiques et axonales au niveau d'une cellule unique in vivo. Dans le système olfactif, les neurones sensoriels olfactifs étendent leurs axones de l'épithélium olfactif du nez jusqu'au bulbe olfactif du cerveau. Lorsque plusieurs neurones sensoriels olfactifs projettent vers le bulbe olfactif, ils s'assemblent en faisceaux.

Cela complique l'étude des trajectoires individuelles des axones et de leurs morphologies terminales. Nous avons mis au point une méthode permettant de visualiser in vivo des neurones sensoriels olfactifs individuels par microinjection d'un ADN construct porteur de la GFP dans un lentivirus.

Une transduction réussie avec un lentivirus illumine toute la longueur de l'axone sensoriel olfactif, y compris l'arborisation terminale. En plus de permettre la visualisation de neurones sensoriels olfactifs individuels, cette méthode nous permet de manipuler l'expression génique d'un gène d'intérêt particulier afin d'étudier sa fonction dans un contexte in vivo. Ce protocole utilisant le lentivirus relève du niveau de sécurité biologique 2 et doit être réalisé dans une hotte à flux laminaire.

Pour maintenir un environnement stérile, vaporisez avec de l'éthanol à 70 % tous les objets insérés dans la hotte, préparez et préchauffez un lit d'eau à 37 degrés pendant au moins 20 minutes avant l'injection. Scellez un sac en plastique rempli à moitié d'eau et placez-le sur un bloc chauffant vide de l'incubateur.

Cela permettra aux souris de se remettre après l'injection. Remplir un conteneur de déchets biologiques avec de l'eau de javel à 10 % afin de décontaminer tous les matériaux exposés au virus. À partir de cette procédure, préparer une petite coupelle ouverte contenant de l'éthanol à 70 % et une deuxième coupelle contenant de l'eau distillée stérile.

Dans une hotte à flux laminaire, nous utiliserons une seringue Hamilton d'une capacité de cinq microlitres équipée d'une aiguille de calibre 33. Ce modèle particulier permet d'ajuster la résistance du piston en tournant un cadran de tension situé en haut de la chambre du piston. Cette fonctionnalité assure un contrôle précis du volume d'injection microscopique et permet de stériliser l'aiguille ainsi que la chambre de la seringue.

Aspirez et éjectez répétitivement de l'éthanol depuis la boîte plusieurs fois. Rincez la cartouche de la seringue en aspirant et en éjectant de l'eau stérile plusieurs fois. Placez la seringue en sécurité à l'écart dans le flux laminaire.

Placer des lingettes alcoolisées près de la station d'injection. Préparer une plateforme d'injection offrant une surface surélevée afin de faciliter le positionnement de la souris. On peut utiliser une boîte de culture de 10 centimètres retournée, recouverte de lingettes Kim.

Les souriceaux peuvent être anesthésiés par hypothermie jusqu'à l'âge du sevrage. Découpez un doigt d'un gant en caoutchouc et placez-y le souriceau. Ensuite, placez-le sur de la glace pendant cinq minutes.

Le gant préviendra les brûlures cutanées qui se produiraient en cas de contact direct de la peau avec la glace. Testez l'anesthésie complète en pinçant les pattes arrière et les quatre pattes du petit pour vous assurer que l'animal ne réagit pas. Nous sommes maintenant prêts pour la microinjection de lentivirus. Nous allons démontrer la procédure sur un petit néonatal.

Si un âge plus avancé de souris est utilisé, il faut remplacer l'aiguille de calibre 33 par une aiguille de calibre plus épais afin de pénétrer la surface du crâne. Stériliser la surface du museau de la souris en l'essuyant avec un tampon imbibé d'alcool. Retirer les stocks de lentivirus du congélateur et les décongeler sur de la glace.

Nous avons produit nous-mêmes du lentivirus en laboratoire en utilisant des méthodes établies. En élaborant cette méthode, nous avons constaté qu'une concentration virale minimale de 10 puissance neuf unités infectieuses par millilitre est nécessaire pour obtenir un bon taux de transduction. Aspirez deux microlitres de la solution stock de lentivirus dans la seringue stérilisée de Hamilton.

Placer le souriceau sur le plateau d'injection. Saisir la peau située au sommet de la tête au niveau des oreilles, puis tirer doucement vers l'arrière. Nous avons équipé notre hotte à flux laminaire d'un microscope stéréoscopique.

Pour diriger précisément les micro-injections, recherchez à la surface dorsale du crâne au niveau du prosencéphale le contour du bulbe olfactif. Nos cibles de micro-injection entourent étroitement le bulbe olfactif, mais ne doivent pas inclure le bulbe lui-même. Nous effectuons quatre injections dans l'épithélium olfactif de chaque petit.

Ces positions, représentées par des points bleus, nécessitent que l'aiguille soit insérée selon un angle dirigé vers la ligne médiane. Les deux injections supplémentaires, représentées par des points verts, sont décalées, plus médianes et antérieures au bulbe olfactif. Ces injections peuvent être effectuées selon un angle oblique.

Les recommandations concernant les angles d'insertion de l'aiguille tiennent compte de la position ventrale de l'épithélium olfactif, qui se situe principalement sous le bulbe olfactif. L'accès perpendiculaire est donc restreint. Insérez l'aiguille par le sommet de la cavité nasale, environ trois millimètres sous la surface de la peau.

Pour atteindre l'épithélium olfactif. Une main exercée doit sentir la diminution de la résistance lorsque l'espace luminal de la cavité nasale est atteint. Cette zone doit être évitée.

Micro-injecter 0,5 microlitre de solution virale par position. Là encore, en choisissant deux sites par côté, gauche et droit, soit quatre injections au total de 0,5 microlitre. Chaque souris nécessite ainsi deux microlitres de virus par séance d'injection.

Encore une fois, faites attention de ne pas injecter le bulbe olfactif à sec afin d'éviter toute solution virale résiduelle ou tout sang pouvant s'échapper du site d'injection ou des orifices des narines. À l'aide d'un essuie-alcool, jetez les essuies dans le récipient contenant de l'eau de javel diluée et placez immédiatement la souris injectée dans l'incubateur à lit d'eau pour sa récupération. Désinfectez la seringue et l'aiguille en répétant la procédure de stérilisation effectuée lors de la préparation. Les souris injectées peuvent être replacées dans leur cage 30 minutes après leur récupération dans l'incubateur à lit d'eau.

Cette microinjection complète peut être répétée après quatre heures. Si vous souhaitez augmenter le nombre de neurones sensoriels olfactifs qui seront infectés, les neurones sensoriels olfactifs infectés peuvent être visualisés sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours. Les animaux sont sacrifiés et perfusés pour l'observation au moment souhaité.

À l'aide de méthodes standard, afin de visualiser les trajectoires des neurones sensoriels olfactifs transduits au niveau de la cellule unique ainsi que les terminaisons axonales, nous disséquons et sectionnons le bulbe olfactif dans un plan coronal avec une épaisseur de 60 micromètres. La coupe contient ainsi toutes les couches cellulaires du bulbe olfactif, y compris les faisceaux d'axones des neurones sensoriels olfactifs et les terminaisons axonales, qui entrent en synapse au sein de structures glomérulaires situées à la surface du bulbe, en vue d'une immunohistochimie en suspension. Des coupes sérielles du bulbe olfactif sont réalisées et rassemblées collectivement dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate.

Transférez les sections flottantes dans un flacon conique de 50 millilitres. Une fois que les sections se sont déposées au fond du flacon, aspirez le tampon salin phosphate. Prenez garde de ne pas aspirer les sections.

Vos sections sont remises en suspension dans 10 millilitres de tampon frais afin d'éliminer tout fixatif résiduel ou matériau d'inclusion. Prélèvez immédiatement cette suspension à l’aide d’une pipette et transférez-la dans un flacon conique de 15 millilitres, en veillant à récupérer toutes les sections flottantes, aspirez la solution de rinçage, puis percez les sections avec une solution de Triton X-100 à 0,3 % dans du tampon salin phosphate, et placez le flacon sur une plateforme agitée pendant 10 minutes. À température ambiante, vous pouvez ensuite suivre un protocole standard de coloration immunohistochimique dans le même flacon conique, en répétant les étapes d'aspiration et d'agitation selon les besoins pour ce volume, tout en conservant un volume de 10 millilitres pour les étapes de coloration et de rinçage.

Voici une liste d'anticorps que nous utilisons pour la double coloration des neurones sensoriels olfactifs positivement transduits et de la population générale des neurones sensoriels olfactifs. Pour une pénétration optimale des anticorps dans les sections de bulbe de 60 microns, il est recommandé une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. La durée de chaque lavage ne doit pas être inférieure à 20 minutes.

Étaler délicatement chaque section sur une lame en verre à l’aide d’un pinceau, puis monter chaque lame avec du FloraMount G supplémenté d’une solution de colorant pour la chromatine. S’efforcer d’éliminer toutes les bulles du milieu de montage. Monter les sections en rangées afin de simplifier l’étape ultérieure de criblage.

Analysez ces couches sur vos sections de bulbe immuno-marquées à la recherche de fibres axonales et de terminaisons positives pour la GFP. À l’aide d’un microscope à fluorescence, les terminaisons nerveuses infectées positivement peuvent ensuite être observées par microscopie confocale. Il est utile d’étalonner le plan focal dans la région d’intérêt en utilisant les canaux DPI et protéine marqueur olfactif.

Ces résultats montrent une fibre axonale unique de neurone sensoriel olfactif et son terminal axonal au sein du glomérule, où le CO est marqué en rouge par la protéine marqueur olfactif et les corps cellulaires de neurones sensoriels olfactifs infectés par vlu deux en gris. Les corps cellulaires des neurones sensoriels olfactifs infectés ainsi que leur bouton dendritique peuvent également être visualisés au sein de l'épithélium olfactif si ce tissu a été inclus lors des étapes de dissection et de marquage immunohistochimique. Ma projection confocale nous offre une morphologie extrêmement détaillée du trajet d'extension axonale et de l'arborisation terminale d'un neurone sensoriel olfactif unique. On peut observer le crochet de la fibre axonale en direction de sa cible glomérulaire, ainsi que les détails de son schéma de ramification au sein du neuropile glomérulaire.

La méthode de microinjection lentivirale permet la visualisation de l'axone d'une cellule unique, des morphologies des neurones sensoriels olfactifs, et autorise des études impliquant la manipulation de l'expression génique ; la transduction par lentivirus entraîne une intégration génomique stable des constructions. Le lentivirus n'infecte pas transsynaptiquement les cellules voisines. La visualisation peut être obtenue en aussi peu que trois jours et a été confirmée pour durer au moins trois mois, probablement plus longtemps.

Les neurones sensoriels olfactifs ne sont pas facilement infectés par une perfusion nasale de solution de lentivirus. Par conséquent, une microinjection à travers la surface est nécessaire dans cette procédure. Voilà donc notre procédure de microinjection de lentivirus.

J'espère que vous avez trouvé toutes ces informations utiles pour parvenir à obtenir des morphologies cellulaires uniques. Bonne chance dans vos recherches.