T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Bonjour, je m'appelle Richard Lin et je suis chercheur au sein du groupe de la professeure TI Mercy, à la Division des sciences et technologies de la santé du MIT et de Harvard. Le projet sur lequel je travaille consiste à quantifier et à capturer les lymphocytes T CD4 positifs et C3 positifs. Le sang du patient doit être utilisé dans des contextes à ressources limitées.

Juste devant moi, nous avons un dispositif microfill composé de PDMS, qui est du Polyméthylsiloxane. Le dispositif, le canal lui-même, a une hauteur de 50 micromètres et le volume total dans le dispositif est de 10 microlitres. Il s'agit donc d'un dispositif extrêmement précis que nous allons utiliser pour capturer les lymphocytes T auxiliaires.

Fondamentalement, la référence diagnostique pour les patients infectés par le VIH. La surface du dispositif microfluidique a déjà été préparée avec des protéines et des anticorps spécifiques des cellules CD4 présents dans la seringue. Pour l'instant, nous avons uniquement un tampon biologique PBS à un pH de 7,4, que nous allons maintenant faire circuler dans le canal afin d'éliminer l'excès d'anticorps anti-CD4.

À ce stade, le débit n'a pas besoin d'être contrôlé, car nous cherchons simplement à éliminer l'excès de composé, et la valeur du débit n'a pas réellement d'importance. Voici où se situeront les entrées du dispositif, et là se trouveront les sorties, à ma gauche et à votre droite ici. Je vais maintenant rincer l'excès de solution d'anticorps ; si vous observez attentivement la sortie, vous verrez le liquide s'écouler. Il s'agit d'une très faible quantité, mais en regardant de près, vous pouvez constater qu'un filet de liquide sort du canal à travers le tube.

À présent que nous avons éliminé la solution d'anticorps excédentaire, nous pouvons nous préparer à injecter le sang. Je vais donc débrancher le tube de l'entrée. Nous allons maintenant ouvrir une nouvelle seringue pour le sang, du sang humain, du sang total.

Il ne s'agit donc pas d'un échantillon de patient, mais d'un échantillon sain, provenant d'un sujet sain, pendant que nous nous préparons à injecter le sang dans le dispositif microfluidique. Nous allons donc fixer la seringue sur la pompe à seringue. Maintenant, nous allons l'allumer et vous pouvez observer les débits de la seringue ; nous l'avons réglé à cinq microlitres par minute.

Nous allons maintenant nous préparer à injecter dans le sang. Nous placerons le pousse-seringue verticalement, car, comme nous le savons, les cellules sanguines forment un sédiment et nous voulons que les cellules s'écoulent dans le canal. Il est donc préférable que le sédiment cellulaire se dépose au fond, juste à proximité de notre tubulure.

Le dispositif est désormais entièrement configuré et prêt à l'emploi. Le volume de mon dispositif est de 10 microlitre par 10 microlitre. Et le volume que nous souhaitons faire circuler dans la paroi du canal est également de 10 microlitre.

Ainsi, je peux déterminer si j'ai introduit suffisamment de sang en observant simplement la couleur du canal : s'il est entièrement rouge et complètement rempli, cela signifie que j'ai injecté 10 microlitres et que je dois arrêter le poussoir de la seringue. Maintenant, je vais appuyer sur le bouton de démarrage et cela va démarrer, parfois cela prend un certain temps avant que le sang n'entre effectivement dans le canal. Cela est souvent dû à la pression.

Par exemple, lorsque nous plaçons la seringue, nous devons parfois aspirer ou injecter le liquide en fonction des besoins afin de réguler la circulation du sang dans le tube. Cela peut prendre un certain temps, mais une fois que la perfusion commence dans un canal, le débit est fixé à ly par minute, ce qui correspond à ce que nous souhaitons. Il faut donc faire preuve d’un peu de patience et attendre ; parfois, vous devez patienter deux ou trois minutes avant que le sang n’atteigne le canal.

En fait, vous pouvez constater que le sang commence à entrer dans le canal. Vous pouvez donc voir que l'appareil est presque complètement rempli. Très bien, nous allons maintenant rebrancher le tube à du PBS pour rincer le sang présent dans le canal.

Pour ce faire, nous allons répéter ce que nous avons déjà fait pour retirer le tube. Étant donné que nous devons toujours contrôler le débit de l'écoulement du PBS, nous avons toujours besoin de la pompe à seringue. Toutefois, comme nous n'écoulons plus de sang, il n'est plus nécessaire de maintenir la pompe à seringue en position verticale, car il n'y a aucune cellule dans le PBS.

Nous sommes maintenant prêts, et nous allons maintenant évacuer le sang du dispositif ; je vais de nouveau appuyer sur le bouton pointu ici même. Comme vous pouvez le voir, le dispositif commence à se nettoyer. Il reste encore un peu de sang sur les bords, mais il disparaît lentement.

Une fois que tout le sang sera éliminé, nous augmenterons le débit de cinq microlitres par minute à 20 microlitres par minute. La raison de ce changement est que le sang contient en réalité deux types cellulaires portant des antigènes C quatre positifs. L'un d'eux correspond à ce que nous recherchions, à savoir les lymphocytes T auxiliaires.

L'autre est ce que nous appelons les monocytes. Nous voulons nous assurer que notre dispositif capture spécifiquement uniquement les lymphocytes T auxiliaires, plutôt que les lymphocytes T auxiliaires et les monocytes simultanément. La méthode que nous utilisons pour cela consiste à augmenter le débit, car nous savons que les monocytes sont plus gros que les lymphocytes T auxiliaires.

Ainsi, en augmentant les débits, les monocytes plus gros subiront une pression plus forte pour quitter la surface par rapport aux cellules T auxiliaires CD4+. Donc maintenant, cela fait environ 20 minutes. Ce que j'ai actuellement en main est une solution.

On l'appelle solution de lyse par fax. Son but ici est de lyser les globules rouges. Ainsi, partout où des globules rouges persistent dans le canal, cette solution les lyséra.

Cette solution est diluée 10 fois, 10 fois à partir de la solution mère. Nous allons donc maintenant arrêter la pompe à seringue, retirer le tube et, fondamentalement, remplacer la solution par celle contenue dans cette seringue. J'arrête donc maintenant l'appareil, retire le tube, enlève ceci, prends-le avec cette seringue et le remplace par une nouvelle.

Très bien, maintenant que tout est configuré, nous allons réduire le débit à cinq microlitres par minute. Nous allons donc cliquer sur le débit actuel de 20 et le diminuer à cinq, puis nous allons faire circuler la solution de permis fax pendant 20 minutes. Nous allons maintenant appuyer sur démarrer.

Donc, devant nous se trouve actuellement une image optique du dispositif, prise avec un grossissement de 10 x. Vous pouvez distinguer tous ces points blancs ici. Comment pouvons-nous nous assurer que ces cellules correspondent bien à celles que nous recherchons ?

Nous utilisons donc plusieurs colorants différents pour nous assurer que le premier colorant que nous employons, que nous appelons DAPI, colore le noyau. En effet, le DAPI colore le noyau. Ainsi, toutes les cellules possédant un noyau, comme les globules blancs, sont colorées, tandis que les globules rouges, qui n'ont pas de noyau, ne le sont pas. On peut constater qu'il est réparti uniformément sur l'image. On observe tous ces points bleus, chacun correspondant à une structure colorée en bleu.

est une cellule. La prochaine étape consiste donc à vérifier si les cellules possèdent l'antigène que nous appelons C four positif. Cela est extrêmement important, car l'objectif de notre dispositif est précisément de capturer les cellules C four positives.

Donc, l'anticorps fluorescent que nous utilisons ensuite est bien sûr spécifique de C four. Passez à la diapositive suivante. Dans cette image, les cellules apparaissent beaucoup plus faibles car l'anticorps fluorescent que nous utilisons est généralement destiné aux facts.

Ainsi, la dilution est beaucoup plus élevée. Mais si vous observez attentivement, vous pouvez encore constater qu'il y a des points dispersés dans ce champ de vision. Ils sont assez faibles.

Mais lors d’un examen plus approfondi, nous pouvons constater que ces cellules sont en DC positif, ce qui est bon car c’est précisément ce que nous souhaitons. Et le test suivant consiste, comme je l’ai mentionné précédemment, à distinguer deux types différents de cellules C4 positif : les premières sont celles que nous voulons, à savoir les cellules T auxiliaires, et les autres sont ce que nous appelons les monocytes.

Nous avons donc besoin d'un autre anticorps fluorescent pour différencier ces deux types cellulaires. Nous savons que les lymphocytes T auxiliaires expriment ce que nous appelons des antigènes CD3 positifs, tandis que les monocytes ne les expriment pas.

Donc l'anticorps suivant que nous utilisons est spécifique de CD3, que nous verrons sur cette image. Encore une fois, on peut constater que les points sont dispersés autour du dispositif ; les points semblent plus gros parce que certaines cellules brillent plus intensément, tandis que d'autres le font moins. Ce que je veux dire, c'est qu'une grande partie de ce phénomène relève de la chance dans ce cas, mais dans la plupart des cas, ces points, en rouge vif, correspondent toutes à des cellules.

Nous voulons donc, encore une fois, vérifier que nos cellules sont positives pour le CD4 et positives pour le CD3. Dans ce cas, on peut constater qu'une grande partie de nos cellules sont positives pour le CD3, ce qui est positif. Cela nous confère une spécificité dans notre capture.

Le grand excès, cela pourrait être de la ferraille, mais souvent ce qui se produit, c'est qu'une cellule a simplement capté plus de CD3, le CD3 s'accumulant sur elle-même. Dans cette image, il s'agit de l'une des données que nous avons recueillies pour ce dispositif microfluidique, et c'est fondamentalement un procédé de capture cellulaire. Dans les diapositives précédentes, vous savez, celles-ci, vous pouvez constater qu'il y avait beaucoup, vous savez, d'images avec des cellules dessus.

Mais à quoi s'accumulent-ils réellement ? Eh bien, ils s'accumulent selon un profil de capture cellulaire, dans lequel on peut tracer sur l'axe des X la distance par rapport à l'entrée et sur l'axe des Y le disque de capture cellulaire. On constate qu'au long du dispositif, la densité est initialement très élevée, puis diminue progressivement, ce qui correspond à ce à quoi nous nous attendrions, puisque nous capturons les cellules C4 positives et C3 positives provenant du sang, dont la concentration diminue au fur et à mesure dans l'échantillon sanguin.

Et c'est fondamentalement ainsi que nos données sont généralement présentées.