La quantification et l'analyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le contrôle génétique de la formation de translocations par appariement simple brin dans des cellules diploïdes de levure bourgeonnante. Cela est réalisé en premier lieu en inoculant des cultures avec des colonies isolées d'un génotype spécifique et en les faisant croître toute la nuit. La deuxième étape de la procédure consiste à induire la formation simultanée de cassures double brin par l'endonucléase Ho sur deux chromosomes, en ajoutant du galactose aux cultures.

Les dilutions suivantes de ces cultures sont ensemencées sur des milieux sélectifs et non sélectifs. La dernière étape consiste à déterminer la fréquence de translocation en comptant les colonies apparaissant sur les milieux sélectifs et non sélectifs. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant le contrôle génétique de la formation de translocations par brin simple, une modulation par des modifications de la fréquence de formation de translocations induites par ho chez des souches de génotypes différents.

Les implications de cette technique s'étendent aux conséquences de l'exposition aux rayonnements thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, car les cassures double brin de l'ADN et la formation de translocations sont les conséquences principales de ce traitement. Pour commencer la procédure de détermination des fréquences de translocation induites, ensemencer 10 à 20 cultures indépendantes d'un millilitre de milieu YPG (glycérol-lactate au tryptone-yeast) avec des colonies uniques du génotype souhaité, puis incuber les cultures toute la nuit à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif. Lorsque les cultures ont atteint la densité cellulaire souhaitée, ajouter du galactose à 20 % aux cultures pour obtenir une concentration finale de 2 %. Le galactose induira l'expression de l'endonucléase Ho, qui provoquera des cassures double brin au niveau de l'allèle *his3-δ5’* sur le chromosome 3 et de l'allèle *his3-δ3’* sur le chromosome 15 ; incuber pendant quatre heures à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif.

L'étape suivante est cruciale pour la réussite de la procédure. Une dilution et une mise en boîte soigneuses des cultures sont impératives. Si vous obtenez des fréquences de translocation suffisamment reproductibles pour permettre des comparaisons statistiquement significatives entre souches de génotype différent, après quatre heures, ensemencez sur milieu dépourvu d'histidine ainsi que sur YPD des dilutions appropriées des cultures, en visant environ 100 à 200 colonies par boîte. Incubez les boîtes à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Lorsque des colonies apparaissent, on peut déterminer la fréquence de translocation. Les rendements de mise en culture avant et après l'induction de l'expression de l'endonucléase ho indiqueront si la présence ou l'absence de l'un ou l'autre des chromosomes de translocation affecte la capacité à survivre à la formation de cassures double-brin. Cela permet de fragmenter une copie de chacun des chromosomes trois et quinze afin de déterminer les rendements de mise en culture pré-induction.

Tout d'abord, prélevez un aliquot de cellules de chaque culture réalisée pendant la nuit et déterminez le nombre de cellules en effectuant un décompte à l’aide d’un cytomètre sanguin. Ensuite, utilisez une dilution appropriée pour ensemencer environ 100 à 200 cellules sur du YPD et incubez pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu’à apparition des colonies. Ajoutez 20 % de galactose aux cultures restantes pour obtenir une concentration finale de 2 %, puis incubez à 30 degrés Celsius pendant quatre heures afin de déterminer l’efficacité de la mise en culture après induction.

Prélève un aliquot de cellules de chaque culture après quatre heures d'induction et détermine le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Effectue une mise en plaque pour compter environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD, puis incube pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu'à l'apparition des colonies. Une fois les colonies apparues sur les plaques, l'efficacité de la mise en plaque peut être déterminée. Les clones porteurs de translocation putative peuvent être analysés par transfert de Southern.

Cette procédure utilise de l'ADN génomique préparé à partir d'une seule colonie recombinante « hiss » issue de chaque essai indépendant ; elle digère environ quatre microgrammes de chaque échantillon d'ADN avec l'endonucléase de restriction BAM H I, sépare les fragments digérés par BAM H I sur un gel d'agarose à 0,7 %, puis transfère ces fragments sur une membrane en nylon chargée positivement. L'hybridation s'effectue avec une sonde marquée au P 32 obtenue par amorçage aléatoire à partir d'un clone génomique BMH I de 1,8 KILOBASE contenant le gène HIS trois. Visualiser les fragments d'ADN par autoradiographie ou imagerie phosphorée. Une autre méthode pour analyser les clones porteurs d'une translocation présumée consiste à effectuer une analyse par caryotype chromosomique.

Les chromosomes sont d'abord préparés à partir de recombinants hiss sélectionnés, puis séparés dans des bouchons d'agarose sur un gel d'agarose à 1 % dans un champ électrique homogène à champ pulsé orienté ou CHEF, à 14 degrés Celsius. Les paramètres suivants sont utilisés : premier bloc, 14 degrés Celsius, temps de commutation de 72 secondes et 15 heures à six volts par centimètre ; second bloc, 14 degrés Celsius, temps de commutation de 122 secondes et 11 heures à six volts par centimètre. À l'issue de l'électrophorèse, visualiser les chromosomes en colorant le gel avec du bromure d'ethidium pendant 30 minutes, puis en irradiant avec des UV et en faisant une décoloration, et transférer les chromosomes vers une membrane chargée positivement par action capillaire.

En conditions dénaturantes, l'hybridation s'effectue avec une sonde marquée au P 32 obtenue par amorçage aléatoire à partir d'un clone génomique de 1,8 kilobase Bam H I contenant le gène hiss. Trois gènes permettent de visualiser les chromosomes par autoradiographie ou imagerie phospho. La fréquence des translocations chromosomiques peut être calculée en divisant le nombre de colonies phototrophes à l'histamine par le nombre total de cellules viables déterminé par ensemencement sur YPD.

Dans cet exemple, la fréquence de recombinaison calculée est d'environ 3 %. Le test permettant de mesurer les fréquences de translocation induites peut être réalisé à l’aide de souches possédant différents génotypes, afin de comparer les différences de capacité à réparer les cassures double brin par brin simple. Un genou, tel qu’illustré sur ce graphique représentatif. Les fréquences de translocation obtenues, tant de manière sélective que non sélective, avec l’homozygote nul RAD 51 delta, étaient statistiquement différentes de celles obtenues dans les conditions correspondantes avec la souche sauvage, avant et après l’ensemencement post-induction.

Les rendements sont déterminés en divisant le nombre total de cellules formant des colonies viables par le nombre total de cellules présentes en culture, déterminé par comptage au cytomètre sanguin, comme indiqué dans ce tableau avant et après l'ensemencement post-induction. Les rendements n'étaient pas significativement différents pour les cellules de type sauvage, ce qui suggère que la présence ou l'absence de l'un ou l'autre chromosome de translocation n'affecte pas la capacité à survivre. Formation de cassures simple brin (DSB).

Les clones porteurs d'une translocation présumée peuvent être analysés par une analyse génomique par Southern blot. Une représentation schématique des chromosomes concernés avant et après la formation de la translocation est présentée ici. Les tailles des fragments de restriction contenant les séquences pertinentes, générés par la digestion BAM H one de l'ADN génomique provenant de souches parentales et recombinantes et révélés sur les blots par hybridation avec un fragment de 1,8 kilobase BAM H one, sont indiquées.

Ses trois clones génomiques sont indiqués en paires de kilobases pour l'analyse par Southern blot. L'ADN génomique est digéré par l'endonucléase BMH1 et hybridé à une sonde de 1,8 kilobase marquée au P32. La sonde HIS3 permet de visualiser ces fragments diagnostiques.

0,8 kilobase HIS trois delta 201,7 kilobase hiss trois delta trois prime 4 kilobase T 3 15 5 kilobase T 15 trois et huit kilobase hiss trois delta cinq prime fragments. La voie A est le diploïde parent. La voie B est un recombinant de translocation non réciproque hiss plus et la voie C est une translocation réciproque his plus.

L'analyse recombinante du chromosome par BLO peut également être utilisée pour examiner les clones porteurs de translocations. Les chromosomes intacts, préparés dans des bouchons d'agarose, sont séparés par électrophorèse CHEF et le gel est coloré avec du bromure d'iridium puis visualisé sous lumière UV. Les chromosomes séparés sont ensuite transférés sur nylon et hybridés avec la sonde marquée au P32 de 1,8 kilobase.

Ses trois sondes permettent de visualiser le chromosome entier de 1,1 mégabase du chromosome 15, le chromosome de translocation T15;3 de 15,8 mégabases, le chromosome de translocation T3;15 de 0,6 mégabase et le chromosome 3 entier de 0,3 mégabase. La piste A correspond au parent déployé. La piste B correspond à A his avec un recombinant de translocation non réciproque, et la piste C correspond à A his avec un recombinant de translocation réciproque.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer la fréquence de formation de translocations suite à plusieurs cassures double brin induites par une stimulation ho.