Imagerie des récepteurs d'estrogènes α chez le rat artérioles Pial aide d'un microscope numérique immunofluorescence

L'objectif général de cette procédure est de décrire une technique simple permettant d'optimiser la coloration et la visualisation du récepteur des œstrogènes alpha à l'aide de sections transversales de vaisseaux peel prélevés sur des cerveaux de rats femelles. Cette méthode consiste tout d'abord à extraire les vaisseaux peel colorés au bleu d’Evan depuis la surface du cerveau, puis à les découper en anneaux de huit microns à l’aide d’un cryostat après sectionnement. Les coupes transversales sont montées sur des lames et incubées avec l’anticorps primaire dirigé contre le récepteur des œstrogènes alpha.

Ensuite, les sections sont incubées avec l'anticorps secondaire et une contre-coloration en utilisant un milieu de montage contenant dpi. Enfin, les segments de vaisseaux pelliculés marqués par fluorescence sont observés et convertis en images 2D à l'aide d'un logiciel de mise au point sur profondeur étendue. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le récepteur des œstrogènes alpha des artérioles pelliculées, grâce à l'utilisation d'un microscope immunofluorescent Nikon associé à un logiciel de profondeur de mise au point étendue.

Je m'appelle le Dr Marguerite Littleton Kearney. Aujourd'hui, le Dr Neil Far ani, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, va démontrer une procédure simple afin d'optimiser la visualisation et la coloration du récepteur des œstrogènes alpha. In peel.

Artères thoraciques d'un cerveau de rat qui a été perfusé avec un colorant bleu d'Évans et stocké à moins 70 degrés Celsius. À l'aide d'un microscope stéréoscopique, identifier les artères péliculaires à la surface du cerveau et les retirer à l'aide de pinces fines. Enlever soigneusement tout tissu cérébral adhérent.

Placer les artères dans un petit tube à essai sur de la glace. Fixer les artères dans du formaldéhyde glacé à 2 % dans 0,1 mole de PBS pendant 30 minutes. Pour préparer les artères au sectionnement, verser le milieu d'incorporation sur un disque de congélation réglé à moins 20 degrés Celsius.

Placer un fragment d'artère à plat sur le chug et attendre qu'il gèle. Une fois qu'il est solidement congelé, positionner l'artère verticalement dans le milieu d'inclusion sur le plateau de congélation du cryostat. Veiller à ce que l'extrémité de l'artère soit orientée vers l'avant.

Tenez l'artère avec une pince jusqu'à ce qu'elle soit solidement congelée. Placez le disque de congélation avec l'artère dans la tête du cryostat, puis découpez des anneaux artériels de huit micromètres directement sur une lame. Montez les sections artérielles sur une gélatine au chromate de potassium.

Déplacez délicatement les lames à l’aide de deux pinceaux afin d’aligner les anneaux artériels. Conservez les lames préparées dans une boîte à lames au réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit. Retirez les lames du réfrigérateur et laissez-les atteindre la température ambiante sur la paillasse.

Lavez les lames avec un à 1,5 millilitre de PBS 0,1 molaire. Après 10 minutes, éliminez le PBS et répétez l'opération deux fois supplémentaires. Après le dernier lavage au PBS, incubez les lames dans un millilitre de chlorure d'ammonium 50 millimolaire pendant 30 minutes à température ambiante afin de réduire la fluorescence endogène. Lavez ensuite les lames au PBS 0,1 molaire trois fois, 10 minutes par lavage, comme décrit précédemment. Ensuite, bloquez les lames dans une solution de PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 % de sérum de chèvre normal pendant 30 minutes pour réduire la liaison non spécifique de l'anticorps primaire.

Après la saturation, incuber les lames avec l'anticorps primaire dirigé contre ER alpha, dilué à une concentration de 1/500 dans la solution de blocage, toute la nuit à quatre degrés Celsius. Retirer les lames du réfrigérateur et les ramener à température ambiante. Éliminer tout anticorps primaire non fixé par lavage avec 1 à 1,5 millilitre de PBS 0,1 % effectué 3 fois pendant 10 minutes.

À chaque fois, incuber les lames avec le second anticorps anti-lapin conjugué à Oregon Green 488 dans la solution de blocage pendant deux heures, à l’abri de la lumière et à température ambiante. Après l’incubation, laver les lames trois fois dans du PBS 0,1 M, avec 10 minutes par lavage, puis les placer sous une hotte ventilée. Déposer une goutte de milieu de montage contenant du DAPI sur les échantillons, puis poser une lamelle par-dessus. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis incolore et laisser sécher complètement.

Insérez les lames préparées contenant les segments de vaisseaux de pelure colorés sous le microscope et effectuez les réglages nécessaires pour visualiser les zones d'intérêt marquées par fluorescence. La visualisation de l'ER alpha coloré constitue l'étape la plus délicate de cette procédure. Repérez le plan du vaisseau coupé présentant les récepteurs les plus nets.

Commencez avec un grossissement de 100 fois, puis augmentez le grossissement jusqu'à 600 fois. Utilisez la caméra pour capturer des images dans les canaux DPI et ZI respectivement pour les noyaux cellulaires et DR alpha, puis utilisez un logiciel pour convertir plusieurs vues de segments vasculaires en images 2D. Ici, les résultats de la coloration immunofluorescente pour ER alpha sont montrés en vert et la contre-coloration avec DPI.

En bleu, dans un anneau d'artère peel isolé du cerveau d'un rat femelle, les images fusionnées suggèrent la présence d'un récepteur nucléaire des œstrogènes alpha. En combinant des images Zack, il est possible d'obtenir une image nette de l'immunofluorescence du récepteur ER alpha, tout en tenant compte de contrôles négatifs d'autofluorescence. Des contrôles négatifs doivent être réalisés pour les anticorps primaire et secondaire. Remarquez l'autofluorescence distincte le long du côté endothélial d'une artère qui n'a pas été incubée avec l'anticorps secondaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'isoler et de décoller les artères de la surface du cerveau, puis de préparer des anneaux transversaux de huit microns. De plus, vous devriez savoir comment détecter le récepteur des œstrogènes alpha marqué au fluorochrome et visualiser les récepteurs à l'aide d'un microscope immunofluorescent numérique et du logiciel Nikon Extended.