Les changements d'équilibre dans la structure de l'ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer comment les molécules d'ARN se replient à l'aide d'une empreinte de radicaux hydroxyles. Cette approche repose sur le marquage en extrémité, la purification sur gel et le pré-repliement de l'ARN, ce qui garantit l'intégrité conformationnelle de l'ARN avant l'étape suivante de repliement induit par le magnésium. Ensuite, les réactifs de Fenton sont mélangés afin de générer des radicaux hydroxyles, capables de cliver la chaîne principale de l'ARN en fonction de son accessibilité au solvant. Puis, les produits de clivage de l'ARN sont séparés par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.

Les intégrales des bandes sont quantifiées à l'aide d'un logiciel d'analyse de footprinting semi-automatisé. L'objectif ultime est de générer des isothermes de repliement reflétant la formation de la structure tertiaire de l'ARN. Cela est réalisé en ajustant les intégrales des bandes normalisées à la saturation fractionnaire.

Les isothermes peuvent ensuite être ajustées à l'équation de Hill. Le principal avantage du footprinting hydroxyle est que vous obtenez des informations sur la structure tertiaire de l'ARN en utilisant des produits chimiques peu coûteux, car les radicaux hydroxyles de petite taille, très réactifs, constituent des sondes idéales pour distinguer les nucléotides accessibles au solvant de ceux qui sont enterrés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale de l'ARN.

Par exemple, comment les ribosomes utilisent-ils les ions métalliques pour atteindre leur conformation active ? L'empreinte par radical hydroxyle peut être utilisée pour comprendre les principes fondamentaux de la spécificité et de la reconnaissance de l'ARN. En plus de révéler des informations sur la structure tertiaire de l'ARN, cette méthode peut servir à déterminer précisément les sites de fixation des protéines sur les molécules d'ARN ou d'ADN.

Les principaux défis de cette méthode consistent à prévenir la dégradation de l'échantillon par les ribonucléases et à optimiser la concentration en fer afin d'obtenir un niveau approprié de clivage de l'ARN. En outre, l'analyse détaillée des intervalles de bandes peut s'avérer assez délicate. Le principal avantage de cette vidéo est d'aider le public à comprendre les étapes de planification et la réalisation réussie d'une expérience de cartographie par empreintes de radicaux hydroxyles. Avant le début de ce protocole, préparez tous les réactifs nécessaires à la cartographie conformément aux instructions du protocole écrit.

Conjointement à cette vidéo, l'ARN peut être produit à partir de quatre DFO apparentés et marqués à l'extrémité comme décrit ci-bas. Purifiez l'ARN marqué radioactivement par électrophorèse sur gel dénaturant. Récupérez l'ARN purifié par deux extractions successives du gel à l'aide d'acétate de sodium 0,3 molaire.

Ensuite, précipitez l'ARN en mélangeant 0,5 millilitre de la solution aqueuse avec un millilitre d'éthanol. Incubez le mélange pendant une minute sur de la glace sèche. Après centrifugation de l'échantillon, jetez le surnageant. Lavez le culot d'ARN avec de l'éthanol à 70 %.

Éliminer le surnageant après une centrifugation supplémentaire et sécher le culot sous vide. Ensuite, dissoudre les échantillons d'ARN purifiés marqués au P 32. Dans 330 microlitres de tampon de réaction à une fois, pipeter 30 microlitres de la solution d'ARN dans un nouveau tube de réaction.

Précipitez l'ARN avec de l'éthanol, puis séchez le culot en vide. Une fois sec, ce culot peut être utilisé pour générer l'échelle de référence comme décrit dans la procédure écrite. Dénaturez la solution d'ARN tamponnée restante en chauffant à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Ramenez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, puis effectuez une courte centrifugation pour ramener le condensat en solution. Pour commencer l'expérience d'empreinte, préparez 27 tubes à réaction afin d'obtenir suffisamment d'échantillons pour remplir un gel d'électrophorèse de 30 puits.

Après avoir inclus les échelles et le témoin clivé, déterminez les concentrations finales en ions magnésium et fer de manière à ce qu'elles soient espacées uniformément sur une échelle logarithmique, sur plusieurs ordres de grandeur autour du point médian de la titration. La préparation des ions magnésium dans un tampon réactionnel à une fois est décrite séparément dans le texte. Incubez les solutions d'ARN et d'ions magnésium à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes. Mélangez ensuite 10 microlitres de la solution d'ARN avec 90 microlitres de la quantité correspondante de solution d'ions magnésium et fer.

Pour obtenir un volume final de 100 microlitres, incuber chaque mélange pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Ensuite, laisser les solutions s'équilibrer à 25 degrés Celsius pendant une heure, temps durant lequel se produit le repliement de l'ARN. Pendant ce temps, immédiatement avant d'initier la réaction d'empreinte par les radicaux hydroxyles, préparer le mélange de réaction témoin comme décrit dans le protocole écrit.

Préparez la réaction de peroxydation en pipetant deux gouttes de deux microlitres chacune d'EDTA ferreux, d'ascorbate de sodium et de peroxyde d'hydrogène en haut de l'intérieur du tube à réaction contenant la solution d'ARN, de sorte que les gouttes ne se touchent pas. Démarrez la réaction de footprinting par un mélange vigoureux. Après 15 secondes, arrêtez la réaction en ajoutant 300 microlitres d'éthanol froid pur.

Retournez les tubes trois à cinq fois. Enfin, précipitez, lavez et séchez le culot comme effectué précédemment. En alternative à la réaction oxydative par, la réaction hydroxyle oxydative serait réalisée en ajoutant cinq microlitres du mélange de réaction de Fenton fraîchement préparé aux échantillons. Incubez la réaction oxydative pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius.

Ensuite, ajouter 300 microlitres d'éthanol pur et froid pour arrêter la réaction et mélanger en retournant les tubes. Précipiter à nouveau. Laver et sécher le culot une fois la réaction péri-oxidative ou oxydative terminée.

Resuspendez les pastilles d'ARN sèches dans huit microlitres de colorant de charge pour gel 2. Vérifiez que l'ARN marqué au P 32 est bien en suspension à l'aide d'un compteur Geiger. Préparez un gel de séquençage dénaturant à 8 % de polyacrylamide selon les protocoles standard. À l'aide d'un peigne à 30 puits, chargez les échantillons, y compris deux références et un témoin clivé.

Séparer les fragments d'ARN à 60 à 75 watts pendant deux heures et demie. Exposer le gel séché à un écran phosphorimager pendant la nuit. Analyser l'écran phosphorimager à l'aide d'un système d'imagerie pour une autoradiographie sans film.

Ensuite, transférez le fichier image du gel vers l'ordinateur pour analyse. Pour commencer l'analyse des données, ouvrez Safa, un logiciel open source destiné à l'ajustement et à la quantification de bandes uniques. Chargez la séquence d'ARN sous forme de fichier texte (.txt), puis l'image du gel sous forme de fichier (.gel).

Définissez les bandes et ajustez les intensités des bandes. Ensuite, choisissez une bande de référence et effectuez une attribution d'alignement sur gel des bandes aux nucléotides en vous référant à l'échelle de digestion d'ARN T1. Quantifiez les intensités des bandes et utilisez la fonction de traçage par couleur ou de normalisation pour normaliser et attribuer les résidus potentiellement invariants.

Enregistrez le résultat sous forme de fichier txt. SFA génère un tableau contenant des colonnes, représentant les bandes sur le gel, et des lignes représentant les intégrales individuelles des bandes correspondant au fragment d'ARN. Tout d'abord, les sites protégés qui présentent un changement notable de l'accessibilité au solvant doivent être identifiés en comparant le profil de protection obtenu à partir de l'échantillon sans ion magnésium au profil correspondant à la concentration finale en ion magnésium.

Plus la valeur est faible, plus le nucléotide est protégé contre l'attaque des radicaux hydroxyles, et inversement. Ensuite, créez des courbes de transition des bandes, des intensités des nucléotides individuels ou groupés en fonction de la concentration en ions magnésium, en utilisant un format de feuille de calcul ; mettez individuellement à l'échelle ces transitions selon la fonction de saturation fractionnaire, comme décrit dans la partie textuelle de ce protocole. Comme étape finale, ajustez les données à l'équation de Hill.

Cette analyse met à l'échelle la transition vers la saturation fractionnelle, détermine le point médian de la transition et fournit un test phénoménologique permettant de vérifier si une transition est sigmoïde. Voici des résultats représentatifs d'expériences d'empreinte par radical hydroxyle sur l'ARNr P quatre P six. Les isothermes ont été obtenus à partir de gels de séquençage analysés par Safa, puis ajustés comme décrit dans la section d'analyse.

L'image du gel indique que le clivage de fond est minimal et qu'une attribution au niveau du nucléotide unique est possible grâce à des bandes bien définies dans la piste T. La fragmentation de l'ARN induite par les radicaux hydroxyles est nettement supérieure au niveau du fond. La transition entre faibles et fortes concentrations d'ions magnésium est spécifiquement associée à une diminution de l'intensité de bandes individuelles ou de groupes de bandes, ce qui indique la formation de l'ARN.

La protection de la structure tertiaire fait référence à un nucléotide unique ou à des groupes de nucléotides contigus dont le clivage modifie simultanément les intensités des bandes, quantifiées et normalisées par analyse saffer. Le résultat est un graphique thermique visualisant le degré de protection contre les radicaux hydroxyles. La transition de couleur décrit le changement d'accessibilité après l'ajout de fer magnésique : du blanc au rouge indique des nucléotides plus accessibles, tandis que du blanc au bleu indique des nucléotides plus protégés.

Chaque degré d'ombrage est associé à une valeur numérique, qui peut être représentée sous forme de courbe de protection et analysée à l'aide d'un modèle de liaison tel que l'équation de Hill. Dans cet exemple, la constante d'association à l'équilibre associée à la protection 1 5 3 à 1 5 5 est approximativement deux fois plus élevée que la valeur correspondante de la protection 1 6 3 à 1 6 4. Cette expérience d'empreinte par radical hydroxyle peut être réalisée en un jour et demi si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de porter des gants et une blouse de laboratoire afin d'éviter toute contamination par les ARN. De plus, la concentration finale en fer dépend du système expérimental. Par conséquent, nous recommandons de réaliser une expérience de réponse à la dose avant la réalisation du footprinting selon cette procédure.

D'autres méthodes, telles que l'empreinte du radical hydroxyle résolue en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, à quel moment critique les molécules d'ARN atteignent-elles une conformation incorrectement repliée ou active après leur formation ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie structurale pour explorer les interactions tertiaires intermoléculaires ainsi qu'intramoléculaires des acides nucléiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer la formation de la structure tertiaire des molécules d'ARN. N'oubliez pas que le caate et l'étape au phosphore présentent des risques ; des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection, ainsi que l'utilisation d'un blindage en plexiglas, sont recommandées lors de la réalisation de cette procédure.