Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission
23 janvier 2012
La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, Est un bon modèle pour étudier les processus cellulaires de base. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l'analyse quantitative des cellules vivantes de levure à fission. Dans cette expérience particulière nous nous concentrons sur l'organisation du génome dans le noyau cellulaire, mais la méthode peut également être utilisé pour étudier les facteurs cytosoliques.
L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer quantitativement l'organisation subnucleaire dans les cellules de levure et d'étudier comment elle est affectée par des changements dans les conditions de croissance ou par des mutations. Cela est réalisé en cultivant les cellules de levure en phase logarithmique dans des conditions minimisant la fluorescence autofluorescente. Ensuite, les cellules sont placées dans une chambre de croissance pour être observées au microscope.
Ensuite, des images sont prises afin de mesurer la distance entre différentes structures marquées par fluorescence dans la cellule. Des résultats sont obtenus, montrant des différences dans l'organisation non nucléaire, dépendant des conditions nutritionnelles modifiées durant la croissance de la culture de levure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'épigénétique concernant les interactions entre l'organisation des sous-compartiments ou de la chromatine et la régulation des gènes.
Les poissons et les levures commencent par préparer le milieu minimal d'Édimbourg, ou EMM, ainsi que de l'EMM contenant également du chlorure d'ammonium afin de réduire l'autofluorescence, au lieu de stériliser par autoclavage. Stérilisez la solution de glucose à l’aide d’un filtre de 0,2 micron et ajoutez-la aux milieux stérilisés à l’autoclave. Inoculez trois millilitres d’EMM dans des tubes de 30 millilitres avec des cellules de poissons et de levures.
Fraîchement cultivées sur une boîte de Petri en milieu riche, YEA, boucher légèrement les tubes et incuber les cellules dans un agitateur à 225 tr/min et à 30 degrés Celsius. Maintenir les cellules en phase logarithmique pendant deux jours en les comptant deux fois par jour, matin et soir, à l’aide d’une chambre de Birkhauser, et en les diluant à la densité appropriée. Le jour de l’expérience.
Les cellules doivent être en phase logarithmique précoce par rapport au milieu azoté. Les cellules sont soumises à la procédure décrite dans le protocole écrit afin de les recueillir en un seul culot au fond d'un tube de centrifugeuse : 1,5 millilitre de cellules dans un tube Eppendorf est centrifugé à un maximum de 1,5 RCF, en effectuant d'abord une rotation du tube pendant deux minutes, puis en le retournant de 180 degrés pour une rotation supplémentaire de deux minutes. Éliminer tout le surnageant sauf 10 à 15 microlitres et remettre les cellules en suspension dans le milieu restant, avec un aliquot de lectine filtrée stérile à une concentration de un milligramme par millilitre.
Ajoutez cinq microlitres de solution de lectine dans un coin du coverslip et ajoutez cinq microlitres de culture à la goutte de lectine. Pour créer une chambre de croissance de cellules S pom base, pipetez cinq microlitres de EMM sur une lame propre et retournez le coverslip avec la culture à un angle de 70 degrés au-dessus du milieu, puis laissez-le tomber face vers le bas sur le EMM afin de sceller les bords avec de la graisse de silicone. Coupez l'extrémité large d'une pointe de 200 microlitres et fixez l'extrémité étroite à une seringue de deux millilitres.
Remplissez la seringue avec environ un millilitre de graisse de silicone. Appliquez une fine ligne de silicone sur les bords du couvre-objet en poussant doucement le piston de la seringue pour imaginer la chambre de croissance. Commencez par utiliser l'imagerie en champ clair pour localiser les cellules et creuser.
Obtenez une image nette pour la microscopie confocale. Nous utilisons un microscope à balayage laser Zeiss LSM 700 équipé d'un objectif à immersion huile plan apochromatique 63 fois, et d'un réglage de balayage moyen sur 16 lignes. Réglez les unités de surface à un rapport de 1 à 1,1 afin d'obtenir une coupe optique de 0,8 micromètre.
Balayez les cellules avec des lasers qui détectent l’Alexa 488 et le mCherry ou la GFP. Enregistrez suffisamment d’images pour effectuer des mesures sur 60 cellules pour chaque condition. Passez à une nouvelle chambre de croissance contenant des cellules fraîches.
Après 60 minutes d'acquisition d'images, ouvrez une image dans le programme Zeen Light Edition pour mesurer la distance entre les signaux de différents fluorophores dans le même plan focal. Ouvrez l'outil de mesures et ajustez l'intensité lumineuse et le contraste afin d'identifier le centre de chaque signal fluorescent, par exemple le corps polaire du fuseau et la membrane nucléaire, puis mesurez la distance qui les sépare. Transférez les données vers une feuille de bloc-notes.
Comparez les distances sous-cellulaires moyennes ou médianes entre différentes souches et traitements à l'aide de logiciels ou de tests statistiques tels que le test T ou le test de somme des rangs de Mann-Whitney. Dans cet exemple, la souche PJ 1 18 5 a été cultivée dans du milieu EMM et un échantillon a été placé dans une chambre de croissance pour l'imagerie. Ensuite, un aliquot de PJ 1 18 5.
La culture a été transférée dans du milieu EMMN et incubée pendant 15 minutes avant qu'un échantillon ne soit placé dans une chambre de croissance pour l'imagerie. L'outil de mesure a été utilisé pour mesurer la distance entre le locus et le corps du pôle du fuseau, ainsi que la distance entre le locus et la membrane nucléaire. Comme illustré ici, une différence statistiquement significative a été observée concernant la distance parcourue par l'amas de gènes s'éloignant de la membrane nucléaire en direction du corps du pôle du fuseau dans les cellules privées d'azote, par rapport aux cellules cultivées en présence d'azote.
Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP présentaient une distribution normale, et par conséquent, les distances moyennes ont pu être comparées à l'aide d'un test T. Il existait une différence significative entre les deux valeurs moyennes. Les données mesurant la distance entre la GFP et le NM ne présentaient pas une distribution normale, et par conséquent, les distances médianes ont été comparées à l'aide d'un test de rangs de Mann-Whitney.
Il existait une différence significative entre les deux valeurs médianes suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme la PCR en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la manière dont le niveau d'expression génique corrèle avec les changements dans l'organisation subnucleaire.
Aperçu
Cette étude présente une méthode d'analyse quantitative de cellules vivantes de la levure fissipare Schizosaccharomyces pombe, en se concentrant sur l'organisation du génome au sein du noyau cellulaire. Cette méthode permet aux chercheurs d'explorer comment l'organisation subnucleaire est influencée par les conditions de croissance et les mutations.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Génétique
- Microbiologie
Contexte
- Schizosaccharomyces pombe sert d'organisme modèle pour l'étude des processus cellulaires.
- La compréhension de l'organisation du génome est essentielle pour obtenir des informations sur la régulation des gènes.
- Les techniques d'imagerie en temps réel permettent de révéler les structures cellulaires dynamiques.
- Les changements dans les conditions de croissance peuvent affecter l'organisation cellulaire.
Objectif de l'étude
- Mesurer quantitativement l'organisation subnucleaire dans les cellules de levure.
- Évaluer l'impact des conditions nutritionnelles et des mutations sur l'organisation du génome.
- Fournir une méthode pour l'étude de la dynamique de la chromatine et de la régulation des gènes.
Méthodes utilisées
- Les cellules de levure sont cultivées en milieu minimal jusqu'à la phase logarithmique.
- Les cellules sont préparées pour l'imagerie à l'aide d'une chambre de croissance et de la microscopie confocale.
- Les structures marquées par fluorescence sont imagées afin de mesurer les distances entre elles.
- Une analyse statistique est réalisée pour comparer les distances dans différentes conditions.
Résultats principaux
- Des différences significatives dans l'organisation subnucleaire ont été observées dans des conditions de croissance variables.
- Les mesures de distance entre les signaux fluorescents ont indiqué des changements dans le positionnement de la chromatine.
- Des tests statistiques ont confirmé la significativité des différences observées.
- La méthode fournit des informations sur la relation entre l'organisation subnucleaire et l'expression des gènes.
Conclusions
- La méthode développée est efficace pour l'étude de l'organisation du génome chez la levure de fission.
- Les résultats mettent en évidence l'influence des facteurs environnementaux sur la dynamique de la chromatine.
- Cette approche peut être utilisée pour approfondir l'investigation des mécanismes de régulation des gènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence stratégique pour l'industrie
La microscopie quantitative en fluorescence sur cellules vivantes chez la levure de fission permet une mesure précise de l'organisation sous-nucléaire et de sa réponse dynamique aux changements environnementaux. Cette capacité est essentielle pour réduire les risques liés aux hypothèses précoces de découverte concernant l'architecture de la chromatine et la régulation des gènes. La méthode renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et éclaire les décisions stratégiques à l'intersection de la biologie cellulaire et de la génomique fonctionnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de l'organisation de la chromatine et de son impact sur la régulation des gènes dans des conditions définies.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles en quantifiant la dynamique spatiale du génome en réponse à des perturbations.
- Offre une détection mécanistique des risques associés aux hypothèses reliant l'architecture nucléaire à des modifications de l'expression des gènes.
Développement de criblages et de tests
- Établit des systèmes validés d'imagerie de cellules vivantes pour la mesure reproductible de distances subcellulaires.
- Facilite la standardisation des tests grâce à des sorties quantitatives et analysables statistiquement.
- Permet le criblage de modificateurs génétiques ou environnementaux affectant l'organisation nucléaire.
Recherche translationnelle et préclinique
- Corréle les changements de localisation subnucleaire avec les événements d'induction génique pertinents pour les modèles de maladies.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en reliant la dynamique de la chromatine à des lectures fonctionnelles.
- Offre une évaluation prédictive visant à réduire les risques dans le développement de biomarqueurs translationnels lorsque la position de la chromatine est impliquée.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode d'imagerie quantitative s'intègre dans le continuum de la découverte, depuis les premiers tests d'hypothèses jusqu'à la validation de modèles précliniques, soutenant à la fois les études mécanistiques et la recherche translationnelle.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les relations entre l'organisation de la chromatine et la régulation des gènes.
- Écrantage : Fournit des lectures reproductibles et quantitatives pour comparer des conditions génétiques ou environnementales.
- Analyse : Fournit des mesures statistiquement robustes (distances moyennes, médianes) pour l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les modifications de l'architecture nucléaire à l'induction des gènes, en lien avec la modélisation des maladies.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour l'imagerie de cellules vivantes et l'analyse quantitative dans plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la régulation des gènes.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles d'imagerie de cellules vivantes et garantit la reproductibilité des résultats quantitatifs.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon en fournissant des données solides sur les dynamiques de la chromatine et les relations d'expression génique.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles et des voies en se fondant sur des données quantitatives relatives à l'organisation nucléaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes, en microscopie à fluorescence et en analyse quantitative d'images.
- Exige un accès à la microscopie confocale et à des logiciels analytiques compatibles pour les mesures de distance.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'imagerie et des méthodes d'analyse statistique.
- Une adaptation peut être nécessaire pour différentes souches de levure ou systèmes modèles présentant des fonds génétiques variés.
- Les limites pratiques incluent la gestion de l'autofluorescence et l'assurance d'une taille d'échantillon suffisante pour garantir une puissance statistique.
