Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

L'objectif de cette procédure est de capturer simultanément des aptitudes quantitatives de culture microbienne à l'échelle du génome, de manière précise et à haut débit. Cela est réalisé en transformant d'abord une bibliothèque matricielle de colonies microbiennes dans des plaques de 96 puits et en faisant croître la culture jusqu'à saturation. Ensuite, les cultures saturées sont diluées dans de l'eau, puis déposées sur des plaques d'agar solide.

Ensuite, les plaques solides sont photographiées périodiquement jusqu'à ce que la croissance de la colonie microbienne soit saturée. Finalement, les photographies prises au cours du temps pour la croissance de chaque culture sont converties en mesures quantitatives de la densité cellulaire, et les courbes de croissance observées sont analysées à l'aide de modèles de croissance afin de résumer les mesures quantitatives de la aptitude microbienne. En définitive, on peut obtenir des résultats qui fournissent des preuves d'interactions génétiques en démontrant que des souches microbiennes présentent des aptitudes différentes, soit lorsqu'elles sont combinées à différentes mutations, soit lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions différentes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les méthodes de pincement à haute densité comme SGA ou les expériences de compétition par codes-barres, est que les mesures de capacité adaptative sont plus précises. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement de médicaments anticancéreux, telles que les gènes et processus importants dans la réponse aux dommages de l'ADN et au contrôle du cycle cellulaire, ainsi qu'à la compréhension et à la traduction de ces recherches fondamentales sur les micro-organismes sous forme de cibles thérapeutiques potentielles dans les cellules cancéreuses humaines. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction des télomères et la visi.

Il peut également être appliqué à d'autres domaines de la biologie des levures ou, en effet, à tout domaine où les phénotypes d'aptitude peuvent fournir des informations sur la biologie microbienne. Nous espérons que le QFA pourra être appliqué à de nombreux autres organismes microbiens pour lesquels des bibliothèques en réseau existent. Par exemple, povi e coli, orilla surplus À partir de cultures saturées de la veille, on a cultivé jusqu'à 96 souches de levures indépendantes dans des volumes de 200 microlitres de milieu liquide riche.

Dans une boîte de culture stérile de 96 puits, stérilisez un réplicateur manuel à 96 broches d'un diamètre d'un huitième de pouce en le trempant d'abord dans de l'éthanol à 100 %, puis en le passant à la flamme et en le laissant refroidir. Ajoutez 200 microlitres d'eau stérile dans les puits d'une plaque de 96 puits. Vortexez les cultures de levures saturées et diluez-les en trempant l'outil de broche stérilisé dans les souches trois fois, puis une fois dans la plaque contenant l'eau. Stérilisez à nouveau l'outil de broche et laissez-le refroidir avant de le tremper trois fois dans les cultures diluées. Transférez ensuite la broche sur une plaque d'agar solide.

Après avoir incubé les boîtes de gélose, utilisez un imageur robotique SP s and p pour les imager manuellement afin d'une culture automatisée. Commencez par un réseau rectangulaire de souches indépendantes de levure cultivées sur gélose solide. Dans cet exemple, les souches initiales résultent du croisement d'une mutation interrogée sensible à la température avec la collection de délétions de levure.

1 536 cultures représentant quatre répliques de 384 souches de levures indépendantes sont cultivées sur des plaques SGA à l’aide d’un robot équipé d’un outil de transfert stérile à 96 broches, chaque broche ayant un diamètre de un millimètre ; 384 des 1 536 souches sont transférées dans 4 plaques de culture 96 puits contenant chacune 200 microlitres de milieu sélectif, puis les cultures sont incubées à 20 degrés Celsius jusqu’à saturation. Pour déposer les cultures de levures saturées, commencez par les transférer vers un robot de manipulation liquide et de Resus, puis suspendez-les sur un agitateur magnétique ; diluez les cultures à environ un sur 70 à l’aide d’un outil robotique stérile à 96 broches, en les piquant dans 200 microlitres d’eau stérile.

Après avoir nettoyé et stérilisé l'outil à épingles, déposez les cultures diluées sur des boîtes de gélose. En format 384 puits, transférez les boîtes dans un incubateur humidifié sous contrôle thermique équipé d'un carrousel automatique et d'une trappe d'accès. Pour imager les cultures, utilisez un imageur automatisé robotisé, qui retire à plusieurs reprises les boîtes de l'incubateur, enlève les couvercles, les transfère vers un espace uniformément éclairé situé sous une caméra de 35 millimètres, puis acquiert une image de 5 184 par 3 456.

La résolution pixel remplace le couvercle, puis replace les plaques sur le carrousel d'incubation afin de suivre les emplacements des cultures sur les plaques et les traitements qui leur ont été appliqués. Les plaques sont automatiquement codées par code-barres selon le nom de l'incubateur, la température, un numéro de lot séquentiel unique et la position dans l'incubateur. Les noms d'images sont une concaténation du nom de la plaque et de l'horodatage, et sont générés automatiquement lors de la capture de l'image.

Les plaques sont souvent également étiquetées manuellement afin de garantir qu'elles conservent le même ordre lors des transferts entre les carrousels robotisés. Les fichiers de métadonnées sont des fichiers texte séparés par des tabulations, générés manuellement. Le fichier de description expérimentale FT deux.

Le tableau un est unique pour chaque expérience, mais la description de la bibliothèque FT trois, tableau un peut être largement réutilisée. Une fois l'expérience établie, elle est décrite dans le fichier de description expérimentale FT deux, tableau un, qui contient des colonnes pour le code-barres ou le nom de la plaque généré automatiquement, l'horodatage de début de l'expérience, le traitement de la plaque, la composition du milieu solide à l'agar, le nom de l'écran, le numéro de la plaque de bibliothèque pour les bibliothèques comportant plusieurs plaques, ainsi qu'un numéro de quadrant de répétition pour le passage du format 1 536 puits au format 384 puits. La bibliothèque de souches e est décrite à l’aide d’un fichier de description de bibliothèque FT trois, tableau un, indiquant le génotype cultivé à chaque emplacement de culture.

Dans chaque plaque d'une bibliothèque, on trouve les colonnes suivantes : quatre, nom de la bibliothèque, ORF, numéro de plaque, ligne, colonne de plaque, et une colonne facultative de notes. Un fichier facultatif de noms standards de gènes peut être fourni, FT quatre, tableau un, décrivant le nom standard du gène associé à chaque numéro systématique d'ORFY, permettant d'identifier les souches analysées. Ce fichier contient deux colonnes : ORF et nom du gène, utilisées pour l'analyse des données.

Le flux de travail informatique de QFA nécessite l'accès à une station de travail polyvalente dotée d'un processeur multi-cœur suffisamment puissant. L'outil logiciel d'analyse d'images colonizer et le package QFAR, tous deux documentés en ligne, sont disponibles gratuitement et fonctionnent sur plusieurs systèmes d'exploitation. Exécutez colonizer en utilisant chacune des images de plaque capturées comme entrée, afin de générer un fichier de sortie de colonizer au format FT5, tableau un, pour chaque image. Les fichiers de sortie de colonizer indiquent les estimations de densité des cultures, ainsi que la surface, la forme et la couleur des colonies.

Pour chacun des 384 emplacements sur la plaque d'image, un nom de fichier de sortie est automatiquement copié à partir du nom de fichier image source. Le package QFAR contient des fonctions seldens pour les courbes temporelles de chaque culture afin d'ajuster des modèles logistiques généralisés aux observations et de tracer les résultats. Voir les figures deux et trois pour des exemples.

Les valeurs des paramètres ajustés sont écrites dans des fichiers de paramètres logistiques QFA. Le package QFAR contient également des fonctions de contrôle qualité. Les colonies situées en bordure sont écartées en raison de la disponibilité accrue des nutriments aux bords de la plaque et des difficultés liées à l'analyse d'image.

Les cultures situées près des bords des plaques, celles ayant échoué au SGA et celles dont les génotypes présentent une liaison avec les gènes marqueurs spécifiques à l'écran sont exclues de l'analyse. Plusieurs mesures quantitatives de la capacité d'adaptation sont dérivées des paramètres du modèle logistique de population pour chaque culture. Ces mesures incluent les taux maximaux de doublement de la population et le nombre de divisions depuis l'inoculation jusqu'à la saturation, pour chaque série de cultures réplicates et pour chaque définition de la capacité d'adaptation.

Plusieurs statistiques descriptives des estimations de valeur sélective sont calculées : la valeur sélective moyenne et médiane, l'écart type de la valeur sélective et le nombre de réplicats observés. Les statistiques descriptives sont exportées vers des fichiers récapitulatifs de la valeur sélective QFA FT huit, tableau un, pour des analyses ultérieures. Par exemple, les calculs des scores d'interaction génétique FT neuf, tableau un.

Cette figure montre une courbe de croissance typique sur une échelle logarithmique parmi les 384 QFA. Les cultures croissent à 20 degrés Celsius sur gélose, quantifiées par colonizer, avec une augmentation de la densité cellulaire détectable pour la première fois après environ deux jours. Ce retard est probablement dû à la combinaison d'une phase de latence après inoculation sur milieu solide et d'une limite inférieure de détection de la densité cellulaire.

Ici, 308 courbes de croissance similaires ont été enregistrées à partir d'une seule plaque. Notez que les souches ayant produit une ligne plate étaient très malades ou mortes. Cette figure illustre la comparaison de deux criblages QFA à l'échelle du génome afin de déduire les intensités des interactions génétiques.

Le package QFAR inclut également des fonctions permettant de produire la figure précédente de la courbe de croissance et de générer des listes classées des génotypes examinés ainsi que des estimations de l'intensité des interactions génétiques. Conjointement à une valeur Q indiquant la significativité de l'IGS observée, une expérience QF.A complète à l'échelle du génome et réalisée en quatre réplicats peut être menée à bien en moins de trois semaines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de rester organisé dans le suivi et la dénomination de toutes les plaques et images.

Toutes les plaques doivent être inoculées et les prélèvements effectués dans l'orientation et l'ordre corrects. L'analyse des données repose sur l'exactitude des fichiers texte auxiliaires créés par le scientifique expérimentateur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'estimer la capacité d'adaptation de milliers de cultures microbiennes indépendantes.

Les aptitudes sont estimées en prenant régulièrement des photographies de cultures tachetées, cultivées sur des boîtes de Petri contenant de l'agar solide, en convertissant les images capturées en estimations de densité cellulaire et en générant des courbes de croissance. La modélisation mathématique des courbes de croissance fournit des estimations quantitatives de l'aptitude, qui peuvent ensuite être utilisées pour déduire des relations fonctionnelles entre les produits géniques à l'échelle du génome entier.