Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification
25 février 2012
Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.
L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une méthode appelée purification par affinité en tandem afin d'isoler les partenaires de liaison des protéines. Bonjour, je suis dLAN Bailey de la section de virologie de l'Imperial College London. Dans notre laboratoire, nous étudions les interactions entre les virus et leurs hôtes pour différents membres de la famille des virus.
L'identification des protéines interagissant avec d'autres protéines cellulaires ou virales constitue un excellent point de départ pour étudier les interactions entre le virus et son hôte au cours de l'infection. Dans cette vidéo, j'expliquerai une approche que nous utilisons dans notre laboratoire, la purification en tandem ou marquage TAP. La balise TAP utilisée dans cette étude est une balise en position N-terminale composée de deux unités de protéine G et d'un peptide de liaison à la streptavidine.
Ils sont séparés par une séquence de clivage de la protéase TEV qui permet l'élution spécifique de la protéine cible. Dans cet exemple, EIF quatre E de souris se trouve au niveau de l'extrémité C de cette construction de fusion. Le protocole d'étiquetage TAP est une procédure en six étapes.
Après la transfection et la génération de lignées cellulaires, les cellules sont induites à exprimer la protéine cible marquée avant d’être lysées dans un tampon de lyse doux. Deux étapes de purification par affinité et deux solutions spécifiques sont utilisées pour purifier l’élément cible ainsi que tous les partenaires d’interaction potentiels afin de générer des lignées cellulaires. Les cellules HEC 293 doivent être transfectées avec le vecteur d’expression P met quatre codant.
Les cellules exprimant la protéine appât marquée par la balise TAP sont ensuite sélectionnées à l’aide de cent microgrammes par millilitre d’hygromycine B. Étant donné que le plasmide est maintenu en épisome, il n’est pas nécessaire d’isoler des clones spécifiques. Dix flacons confluents de cellules sont induits par un traitement au chlorure de cadmium à 10 micromolaire pendant 16 heures avant d’être prélevés par raclage dans le milieu. Les cellules en suspension sont ensuite transférées dans des tubes de 15 ml et les cellules sont mises en pellet par centrifugation.
Ces cellules sont ensuite lavées trois fois avec du PBS glacé avant d'être finalement centrifugées. Dans l'étape deux, la lyse cellulaire, les cellules sont lysées dans cinq millilitres de tampon de lyse froid par pipetage répété, puis laissées sur de la glace pendant cinq minutes. Afin d'assurer une lyse efficace, les cellules sont ensuite passées à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille courte et fine de petit diamètre, puis soumises à des cycles de congélation-décongélation.
L'état résultant est réparti dans des tubes de 1,5 ml et les cellules intactes ainsi que les débris sont éliminés par centrifugation. À noter, la taille du culot est nettement réduite après cette étape de centrifugation. Les surnageants de lyzat sont ensuite rassemblés dans un tube conique Falcon de 15 ml et filtrés à travers un filtre de 0,45 micromètre afin d'éliminer tout débris résiduel.
Des aliquotes de 50 microlitres de ce lysat doivent être prélevées pour les analyses ultérieures. Cet échantillon est appelé échantillon un. Étape trois, liaison à l'Aeros IgG de lapin.
Dans cette étape du protocole, les marqueurs protéine G sont immunoprécipités par les anticorps IgG de lapin aros. Pour distribuer les billes aros, retirez l'extrémité du bout apical. Cela permet d'éviter d'endommager les billes.
Resuspendez délicatement la solution d'aros d'IgG de lapin en faisant tourbillonner le flacon avant de transférer les aros dans un tube de 15 ml. Lavez les aros trois fois dans du tampon de lyse refroidi en utilisant une centrifugation à faible vitesse pour clarifier les billes à chaque étape. Les billes d'IgG de lapin en culot doivent être visibles après la centrifugation.
Après chaque étape, retirez soigneusement le tampon sans déranger les billes. Une fois le dernier lavage terminé, ajoutez le lysat filtré et clarifié aux billes compactées et incubez pendant trois heures ou toute la nuit. Il est préférable à quatre degrés C en utilisant un mélangeur rotatif.
Après l'immunoprécipitation, centrifuger les billes agarose et récupérer le surnageant pour les analyses ultérieures. Si nécessaire, vous pouvez utiliser une pointe fine pour éliminer tout liquide résiduel de ce tube. Ce surnageant correspond à l'échantillon deux étape quatre clivage par la protéase TEV.
Dans cette étape, l'appât est clivé à partir des étiquettes protéiques G. Cette étape permet un clivage spécifique de la protéine cible, constituant effectivement une étape d'élution à partir de l'immunoprécipitation par l'IgG de lapin liée aux billes aros. Préparez le mélange de clivage TEV et ajoutez-le aux billes aros à l'aide d'une pipette dont l'extrémité a été coupée, transférez ce mélange dans un tube de microcentrifugation silanisé et retournez-le pour mettre les billes aros en suspension avant une incubation nocturne à quatre degrés C. Prélevez un aliquot de cette réaction de clivage TEV pour analyse.
Ceci est l'échantillon trois. Une incubation nocturne dans le mélangeur rotatif devrait permettre à la réaction TEV d'atteindre une progression quasi complète. Étape cinq, liaison aux billes de streptavidine immobilisées.
Dans cette étape, l'appât Cleve et tous les partenaires de liaison éventuels sont purifiés par affinité à partir de la solution. Tout d'abord, centrifuger la réaction de clivage TEV contenant les billes IgG de lapin aros. Pour former le culot des aros, prélever une OTT du surnageant clarifié afin d'effectuer une analyse.
Ceci est l'échantillon quatre. Retirez soigneusement tout le surnageant restant, qui contient votre protéine cible, dans un tube neuf. Utilisez à nouveau un outil fin.
Centrifuger les pointes pour éliminer tout le surnageant possible. Conserver les billes d’IgG de lapin liées à l’aros pour l’analyse ultérieure. Cet échantillon est le numéro cinq.
Pour éviter d'endommager les billes de streptavidine, retirez l'extrémité d'une pipette jetable. Resuspendez délicatement les billes et transférez-en une aliquote dans un tube siliconé. Lavez les billes de streptavidine avec du tampon S, en clarifiant par une centrifugation à faible vitesse.
Après chaque lavage, retirez soigneusement le tampon. Les billes Strept adin sont très petites et peuvent être facilement déplacées, même en utilisant une pipette fine.
Construire les conseils pour animaux. Après avoir lavé les billes strept adin, ajouter le surnageant provenant de la réaction de clivage par la TEV à ces billes et incuber la réaction pendant trois heures ou toute la nuit à quatre degrés C, en utilisant un mélangeur rotatif.
Après l'incubation, centrifuger les billes streptavidine et retirer le surnageant. Ceci est l'échantillon six. À noter.
La protéine cible est désormais associée aux billes restantes dans le tube. Lavez les billes de streptavidine contenant votre protéine appât avec le tampon de lyse. Pour éliminer toute protéine contaminante supplémentaire, retirez la solution de lavage restante des billes et laissez-les sur de la glace.
Étape six, élution par biotine. Dans cette étape, la biotine est ajoutée aux billes de streptavidine. L'interaction entre la biotine et les billes de streptavidine déplace l'appât, qui retourne en solution.
Ajoutez directement la solution de biotine aux billes et retournez le tube pour mélanger. Incubez la réaction à quatre degrés C pendant trois heures ou toute la nuit en utilisant un mélangeur rotatif centrifuge, le mélange aérosol de biotine et récupérez soigneusement le mélange dans un tube propre. Il s'agit de votre EIT final, appelé échantillon sept.
Les billes de streptavidine restantes constituent l'échantillon huit. En raison de leur faible concentration en protéines, cet éluat final doit être concentré avant analyse. Cette concentration est réalisée à l'aide de colonnes filtrantes à faible poids moléculaire, en réduisant le volume par centrifugation tout en surveillant régulièrement le processus.
Cet échantillon concentré peut être divisé et analysé sur des gels SDS-PAGE par coloration au kumasi et à l'argent. Si les échantillons doivent être analysés par spectrométrie de masse, nous conseillons d'utiliser des gels commerciaux préfabriqués. Des bandes individuelles peuvent ensuite être extraites et les protéines identifiées par spectrométrie de masse.
Dans ce cas, l'appât était murin, EIF pour la protéine E. L'avantage du système « tap » est que vous avez la possibilité d'exprimer votre protéine d'intérêt dans une lignée cellulaire particulière, et selon la lignée cellulaire qui vous intéresse, cela vous permet également d'exprimer la protéine à des niveaux relativement faibles. Vous décidez de, et toutes les modifications post-traductionnelles ainsi que la localisation sont conservées, ce qui vous permet souvent de purifier le complexe natif.
Aperçu
La purification par affinité en tandem est une technique puissante permettant d'identifier les partenaires de liaison des protéines. Cette méthode a été appliquée au facteur d'initiation de la traduction eIF4E afin de co-précipiter les facteurs cellulaires hôtes impliqués dans l'initiation de la traduction.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Virologie
- Études des interactions protéiques
- Biologie cellulaire
Contexte
- La purification par affinité en tandem (TAP) est une méthode utilisée pour isoler des complexes protéiques.
- La balise TAP est constituée de la protéine G et d'un peptide liant la streptavidine.
- Cette technique permet l'élution spécifique des protéines cibles.
- La compréhension des interactions protéiques est essentielle pour l'étude des dynamiques virus-hôte.
Objectif de l'étude
- Isoler et identifier les protéines qui interagissent avec le facteur d'initiation de la traduction eIF4E.
- Étudier l'interaction entre les protéines virales et cellulaires durant l'infection.
- Montrer l'adaptabilité de la méthode TAP à diverses protéines.
Méthodes utilisées
- Transfection de cellules HEC 293 avec un vecteur d'expression marqué TAP.
- Lyse cellulaire et purification à l'aide de billes IgG de lapin et de streptavidine.
- Clivage par la protéase TEV pour l'élution spécifique des protéines cibles.
- Plusieurs étapes de lavage et de centrifugation pour assurer la pureté des échantillons.
Résultats principaux
- Isolation réussie de l'eIF4E et de ses partenaires d'interaction.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode TAP dans l'identification des complexes protéiques.
- Identification de facteurs cellulaires potentiels impliqués dans l'initiation de la traduction.
- Validation de l'adaptabilité de la méthode à d'autres protéines.
Conclusions
- La purification par affinité en tandem est une approche efficace pour l'étude des interactions protéiques.
- La méthode peut être appliquée à diverses protéines cellulaires et virales.
- La compréhension de ces interactions fournit des informations sur la pathogenèse virale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'identification des interactions entre protéines constitue une étape fondamentale dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les programmes de découverte en biopharmacie. La purification par affinité en tandem (TAP) permet l'isolement de complexes protéiques natifs dans des conditions proches des conditions physiologiques, facilitant ainsi une liaison fiable à la cible et la cartographie des voies biologiques. Cette approche réduit les faux positifs lors du criblage précoce et améliore la confiance prédictive dans les campagnes d'identification de composés leaders.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant les partenaires de liaison directs et indirects de protéines cibles telles que l'eIF4E.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à l'identification de membres connus des complexes, tels que l'eIF4G, la 4EBP-1, l'eIF4A et la protéine de liaison à la queue poly-A.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des projets en distinguant les intermédiaires spécifiques du bruit de fond à l'aide de témoins utilisant uniquement la balise TAP.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval en capturant des complexes endogènes avec des modifications post-traductionnelles préservées.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des étapes d'élution définies (protéase TEV et biotine) et à des protocoles de lavage rigoureux.
- Évolutivité : Permet la réutilisation de la plateforme dans différentes lignées cellulaires par expression de plasmide épisomal, évitant ainsi la génération de lignées clonales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Maintient la pertinence pathologique en étudiant l'eIF4E dans l'initiation de la traduction dépendante de la coiffe, une voie régulée de façon anormale dans le cancer et lors d'infections virales.
- Alignement préclinique : Relie les découvertes à une détection mécanistique des risques en identifiant des intermédiaires secondaires qui éclairent le contexte de la voie.
- Avancement ajusté au risque : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon en précisant le mécanisme ciblé et l'intégrité du complexe avant l'optimisation du composé candidat.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode TAP s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant des tests d'engagement de cibles à la validation préclinique, en particulier pour les cibles chez lesquelles l'intégrité native du complexe est essentielle à la fonction.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en isolant les complexes associés à l'eIF4E sous expression inductible.
- Criblage : Assure la préparation des tests grâce à des résultats quantitatifs obtenus par des bandes identifiables en spectrométrie de masse après séparation par SDS-PAGE.
- Analytique : Permet l'analyse comparative entre conditions grâce à des étapes d'élution spécifiques qui réduisent la liaison non spécifique.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans le rapprochement avec des biomarqueurs en identifiant des facteurs d'initiation de la traduction liés aux voies de signalisation oncogéniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Constitue une fonctionnalité réutilisable pour plusieurs protéines cibles grâce à la conception modulaire de l'étiquette TAP et au système d'expression épisomal.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique et préservation des complexes natifs.
- Valeur opérationnelle : Standardisation, reproductibilité et possibilité de mise à l'échelle à différentes lignées cellulaires et protéines cibles.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée grâce à une caractérisation précoce des complexes.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données validées d'interactome.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en clonage moléculaire, transfection transitoire et techniques de purification par affinité.
- Dépend de l'accès à une infrastructure comprenant des centrifugeuses, des mélangeurs rotatifs, des inhibiteurs de protéases et de la spectrométrie de masse.
- Nécessite une standardisation inter-équipes en matière de conception des marqueurs, de protocoles d'induction et de sévérité des lavages.
- Implique des adaptations selon les différentes protéines cibles, les niveaux d'expression et la localisation subcellulaire.
- Comprend des limites pratiques telles que l'interférence potentielle du marqueur et la nécessité d'optimiser le moment d'induction ainsi que les conditions de lyse.
