Préparation de l'échantillon de

L'objectif de cette procédure est d'analyser des extraits sans cellules de mycobactérie tuberculeuse par métabolomique RMN après une première culture, puis de récolter les cellules à un stade de croissance approprié. Ensuite, lyser les cellules et obtenir des extraits sans cellules pour analyse. Re-suspendre les extraits lyophilisés dans un tampon destiné à l'analyse RMN.

Enfin, recueillir les données de RMN et analyser les spectres à l'aide de logiciels afin d'identifier les métabolites. En définitive, l'analyse par RMN de Mycobacterium tuberculosis est utilisée pour montrer la préservation des niveaux de métabolites après divers traitements. La métabolomique par RMN peut être appliquée à des aspects clés de la physiologie de Mycobacterium tuberculosis, tels que les voies métaboliques importantes.

Cette compréhension est essentielle pour élucider les mécanismes d'action et de résistance des médicaments et pour identifier de nouvelles cibles en vue de la conception de médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveraient des difficultés en raison de l'impossibilité de manipuler tous les échantillons de manière strictement identique, ce qui introduirait des variations inutiles et des résultats provenant de mon laboratoire. Steven Luka, doctorant, démontrera les procédures de manipulation des échantillons destinés au traitement par RMN. De mon laboratoire, la responsable du laboratoire de recherche et Robert Fenton, technicien de recherche trois, démontreront désormais les procédures de manipulation des cultures de mycobactéries tuberculeuses lors de l'étude de M. tuberculosis.

La recherche a suivi les pratiques de niveau de biosécurité 3 telles que définies par les directives institutionnelles. Bien que les étiquettes de cette vidéo indiquent Mycobacterium tuberculosis pour des raisons de biosécurité, cette démonstration a utilisé la souche non pathogène Mycobacterium smegmatis. Commencez par décongeler une conservation à 50 % de glycérol de M. tuberculosis sur de la glace.

Inoculer 0,15 millilitre dans 110 millilitres de bouillon M-A-D-C-T-W dans l’ER de 250 millilitres et faire croître les cultures à 37 degrés Celsius avec agitation à 100 tr/min pendant environ six jours. S’il n’y a pas besoin d’antibiotiques, d’ajouts alternatifs ou d’autres traitements. Récolter les cultures destinées aux cultures nécessitant des traitements.

Réservez 0,5 millilitre d'Eloqua sur glace pour la culture, la titration et le contrôle qualité. Appliquez ensuite le traitement souhaité et replacez les cultures dans l'agitateurs après la période de traitement. Prélevez un millilitre et déterminez l'OD 600.

En outre, réserver un échantillon de 0,5 millilitre pour la culture, la titration et le contrôle qualité. Maintenir les cellules sur glace pendant tout le reste du protocole. Récolter les cellules dans quatre tubes de 50 millilitres par centrifugation après lavage avec 15 millilitres d'eau doublement distillée glacée.

Resuspendre les culots dans des aliquotes de 10 millilitres. Prélever deux aliquotes et centrifuger pour obtenir un culot, puis resuspendre le culot cellulaire dans un volume final d'un millilitre d'eau doublement distillée. Si une suspension monocellulaire sans agrégats est souhaitée, faire passer les cellules à travers une aiguille de calibre 27.

Procédez trois fois en transférant la suspension cellulaire d’un millilitre dans un tube de deux millilitres à vis avec matrice de lyse B. Placez l’homogénéisateur FastPrep-24 à l’intérieur de la hotte de sécurité biologique. Insérez les échantillons dans le support d’échantillons en fixant la plaque de maintien. Ensuite, homogénéisez pendant 60 secondes à une vitesse de six mètres par seconde.

Ensuite, centrifuger les échantillons pour former un culot de débris cellulaires et de cellules intactes. Puis faire passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,2 micron dans un tube stérile afin de s'assurer de l'absence de cellules viables. Déposer 0,1 millilitre d'échantillon sur de l'agar MADC.

Congelez les échantillons dans un bain d'éthanol et de glace sèche et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être lyophilisés et analysés dans une installation de RMN. Après deux mois, vérifiez les plaques afin de confirmer l'absence d'unités formant des colonies. Si aucune unité formant des colonies n'est détectée, les échantillons peuvent être retirés du laboratoire de niveau de sécurité biologique 3 pour une analyse complémentaire dans une installation standard de RMN.

Après avoir séché les échantillons jusqu'à dessiccation, les reprendre dans 0,7 millilitre de tampon RMN et transférer dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger pendant trois minutes à 13 000 ×g, prélever 0,6 millilitre et transférer dans un tube RMN de cinq millimètres. Pour l'analyse des milieux, un support personnalisé facilite le chargement de plusieurs tubes RMN dans les rotateurs à la profondeur appropriée.

Ensuite, transférez les échantillons vers le spectromètre RMN pour les insérer dans le changeur d'échantillons A-B-A-C-S à 20 positions. Alternez entre les cultures non traitées et celles traitées avec le médicament. Le premier échantillon doit être préchargé dans l'aimant au début d'une série automatisée.

Pour étalonner l'instrument, optimisez la durée de l'impulsion à 90 degrés à l'aide d'un échantillon unique et ajustez l'instrument pour les échantillons restants. Utilisez l'icône NMR et le calage du gradient. Automatisez le verrouillage, le calage et la collecte des données RMN pour chaque échantillon.

Pour un spectre RMN 1D de l'hydrogène, sélectionnez la séquence d'impulsions avec suppression du signal de l'eau et sculptage d'excitation. Réglez un total de 32 000 points de données, 128 balayages et 16 balayages factices pour un spectre deux DH un C 13 hs QC. Sélectionnez la séquence d'impulsions.

Sélectionnez un total de 2048 points de données avec une largeur de balayage selon la dimension directe H unidimensionnelle et 64 points de données avec une largeur de balayage selon la dimension indirecte C 13. Indiquez également la collecte du spectre avec 128 balayages et 16 balayages factices afin d'obtenir un bon rapport signal sur bruit. Un spectre de m tuberculosis a généré environ 400 pics, incluant 50 métabolites connus.

Par exemple, le traitement des données décrit dans le manuscrit associé a produit ce spectre de métabolites directement ou indirectement associés à la voie de la D-alanine. L'amplitude des intensités des pics est proportionnelle aux concentrations des métabolites présents dans l'extrait cellulaire, ce qui permet de quantifier les perturbations relatives des métabolites et des voies métaboliques entre les échantillons et les traitements. La métabolomique LMR ouvre la voie aux recherches en bactériologie pour explorer la physiologie et la pathogénie chez les microbactéries ainsi que chez d'autres microorganismes pathogènes ou non pathogènes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer plusieurs extraits cellulaires de tuberculose pour la métabolomique par RMN, et surtout maintenir une cohérence tout au long du protocole afin d'obtenir des résultats fiables.