Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

L'objectif général de l'expérience suivante est d'intégrer un construct d'ADN souhaité dans le chromosome bactérien à un locus prédéterminé. Cette intégration est réalisée au moyen d'un protocole d'hybridation impliquant quatre souches bactériennes modifiées. La souche receveuse possède une séquence « plateforme d'atterrissage » composée d'un gène de résistance à la spectinomycine et du gène de la bêta-glucuronidase d'Escherichia coli, flanqués de sites attP, intégrée à son chromosome.

La souche donneuse PJH-one-10 porte un plasmide contenant des sites B encadrant un gène rapporteur de protéine fluorescente rouge, ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique. La souche donneuse PJC-deux porte un plasmide contenant l'intégrase spécifique du site provenant du bactériophage Streptomyces C31, sous le contrôle du promoteur LAC. La quatrième souche, MT616, fournit les gènes de transfert nécessaires à la conjugaison, soit le transfert de plasmides d'une cellule à l'autre, ce qui conduit à la création de transconjugants à partir des souches réceptrices.

Acquisition des deux plasmides nécessaires à l'échange de cassette médié par une intégrase. L'échange de la cassette donneuse du plasmide PJ H one 10 avec les marqueurs de la cassette de site d'insertion sur le chromosome entraîne la perte des marqueurs de la cassette de site d'insertion, SPR et UIDA, et le maintien des marqueurs de la cassette donneuse, RFP et GMR, dans le trans-immigrant obtenu. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, comme la recombinaison homologue, réside dans la simplicité et l'efficacité du protocole.

Il est également transférable à une grande variété de bactéries. La souche réceptrice utilisée dans cette vidéo est une souche S milli latte préparée deux jours avant la procédure d'accouplement afin de créer des transintégrines : inoculer une colonie isolée dans cinq millilitres de milieu TY supplémenté en spectinomycine, puis incuber la souche S milli à 30 degrés Celsius pendant deux jours avec agitation. La veille de la procédure d'accouplement, inoculer chacune des souches E. coli suivantes dans cinq millilitres de milieu liquide LB enrichi de l'antibiotique approprié : DH5α contenant le plasmide d'expression de l'intégrase dans un milieu avec tétracycline, MT616 la souche intermédiaire mobilisatrice avec chloramphénicol, et DH5α contenant le plasmide du cassette donneur dans un milieu avec la gentamicine. Incuber les trois souches E. coli toute la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation constante afin de préparer les cellules pour la procédure d'accouplement. Transférer 1,5 millilitre de chacune des quatre cultures dans un tube et centrifuger à 17 000 × g pendant 30 secondes pour recueillir le culot cellulaire, jeter le milieu et resuspendre chaque culot dans un millilitre de chlorure de sodium stérile à 0,85 %. Centrifuger à nouveau les tubes après avoir éliminé le surnageant, puis resuspendre chaque culot dans 100 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 % à l'aide d'une pipette. Déposer individuellement 10 microlitres de chaque culture lavée pour chaque souche sur une plaque d'agar TY non supplémentée.

Ces points sont des points de contrôle. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chaque souche, à l'exception de l'e coli DH cinq alpha contenant le Pjc deux, dans un tube stérile et mélangez en aspirant et en expulsant plusieurs fois. Déposez 120 microlitres de ce mélange sur la boîte de gélose TY ordinaire. Ce point correspond au témoin négatif sans intégrase.

Enfin, ajouter 40 microlitres de chacune des quatre souches dans un tube stérile, mélanger et déposer 160 microlitres de ce mélange sur la même boîte de gélose TDY. Cette inoculation constitue le point de croisement par échange de cassette médié par une intégrase.

Placez la plaque dans une hotte à flux laminaire et laissez sécher les points pendant environ 20 minutes après cela. Scellez la plaque et incubez-la à 30 degrés Celsius toute la nuit, le jour suivant le tracé du protocole d'accouplement. Les deux points témoins et le point d'accouplement IMCE sur des plaques d'agar TY supplémentées en streptomycine et en gentamicine.

La souche réceptrice S milli porte une mutation conférant une résistance élevée à la streptomycine pour le calcul de l'efficacité IMCE. Resuspendre environ un quart du spot de conjugaison IMCE dans 500 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 %. Effectuer des dilutions sérielles décimales jusqu’à 10 à la puissance moins sept. Ensemencer les dilutions allant de 10 à la puissance moins deux à 10 à la puissance moins cinq sur des géloses TY supplémentées en streptomycine, gentamycine et X-Gl pour sélectionner les transconjugants. Ensemencer les dilutions allant de 10 à la puissance moins trois à 10 à la puissance moins sept sur des géloses TY supplémentées en streptomycine et X-Gl afin de sélectionner à la fois les transconjugants et les récipients potentiels. Pour le nombre total de récipients, incuber les géloses à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

Observer la fluorescence RFP sous lumière verte et à travers un filtre rouge, puis calculer le pourcentage d'efficacité IMCE en comparant les UFC des bactéries transconjugées au nombre d'UFC des récipients totaux. Environ la moitié des transconjugants auront subi un échange réel, devenant ainsi blancs et insensibles après trois jours d'incubation sur milieu Ty complété avec de la streptomycine et de la gentamicine. Aucune croissance ne doit être observée avec les souches témoins suivantes : témoin sans intégrase, s. millilata UW227, témoin E. coli MT616, témoin E. coli DH5α contenant PJH110, et témoin E. coli DH5α contenant PJC2. En revanche, la culture IMCE prélevée à partir du point de conjugaison doit présenter une croissance confluente sur la première strie et de nombreuses colonies sur la seconde strie. Ces deux images suivantes montrent les suspensions ressuscitées d'une dilution 10⁻² du point de conjugaison sur gélose TY-streptomycine-xgl, et sur gélose TY-streptomycine-gentamicine-xgl.

Les colonies bleues sont des recombinants uniques. Alors que les colonies blanches sont des intégrines trans qui ont subi un véritable échange de cassette, elles apparaissent non fluorescentes à la lumière verte à travers un filtre rouge, lorsqu'on observe la dilution au dixième négatif de la suspension de spot d'accouplement sur gélose TY strept cin xgl agar. En revanche, la dilution 10 à la puissance moins deux de la suspension de spot d'accouplement sur gélose Ty streptomycine Gentamycine Xgl Agar présente deux niveaux de fluorescence.

Les colonies plus brillantes correspondent à des colonies bleues et présentent une expression plus élevée de RFP, probablement en raison d'une lecture traversante provenant du promoteur LAC présent dans le vecteur. Les colonies moins brillantes correspondent à des colonies blanches, qui ont subi un échange réel de cassette et contiennent le RFP uniquement sous le contrôle de son promoteur immédiat, sans lecture traversante provenant du promoteur LAC. Ces tendances suggèrent également que les colonies devraient être sensibles à la spectinomycine.

L'efficacité de l'intégration trans, exprimée en pourcentage de bactéries trans-immigrantes par rapport au nombre total de cellules réceptrices, doit être comprise dans une fourchette de 0,5 %. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilisation de la conjugaison bactérienne à l'aide de nos souches modifiées pour insérer des constructions d'ADN dans le chromosome bactérien.