Synthèse en phase solide d'un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant "Sécurité Catch" Méthodologie

L'objectif général de l'expérience suivante est de synthétiser un peptide BSP fonctionnalisé en utilisant des techniques en phase solide. Cela est réalisé en fixant un acide aminé BIS protégé sur une résine d'acide hydroxyéthylbenzoïque. Ensuite, des cycles d'acquisition de protection profonde sont répétés afin d'ajouter des acides bis aminés fonctionnalisés, un processus qui allonge le peptide BIS et expose la fonctionnalité souhaitée.

Enfin, le premier acide aminé bis est modifié avec un acide aminé alpha afin de cliver le peptide BIS de la résine par formation de pyrazine DI-céto. Les résultats obtenus montrent la synthèse réussie d'un peptide BSP fonctionnalisé avec une pureté brute satisfaisante et des rendements isolés constants d'environ 10 %, basés sur une analyse par spectrométrie de masse en chromatographie liquide. Les implications de cette technique s'étendent à la synthèse parallèle et en bibliothèque de peptides bis, car les peptides BIS sont assemblés sur une résine solide, ce qui permet une manipulation plus aisée que dans une réaction en solution, et les sous-produits sont facilement éliminés par filtration.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car bon nombre des étapes sont difficiles à apprendre en raison des nombreux détails importants nécessaires pour s'assurer que toutes les réactions atteignent un état aussi proche que possible de l'achèvement. Avec la synthèse en phase solide, il n'est pas possible de purifier les intermédiaires. Ainsi, afin d'obtenir un produit final pur, chaque réaction doit être poussée au maximum de son rendement possible.

Nous recommandons d'élaborer une liste de contrôle des procédures expérimentales afin d'éviter toute confusion, car les étapes sont de nature répétitive. Ce protocole commence par le chargement du premier peptide BSP, la protection du premier peptide BSP et le bouchage simultané de la résine. Pour commencer, chargez le premier peptide BSP en pesant 114 milligrammes de résine H-M-B-A-A dans un récipient réactionnel de huit millilitres et ajoutez une barre d'agitation magnétique.

Fermez le haut du récipient avec le septum en caoutchouc et purgez le tube avec de l'argon pendant au moins cinq minutes. Pendant ce temps, préparez la solution d'acide aminé BIS activé comme décrit dans le protocole écrit. En complément de cette vidéo, transférez la solution dans le récipient réactionnel à l’aide d’une seringue et agitez sous argon toute la nuit. Le jour suivant, retirez le septum et videz une solution réactionnelle.

Lavez la résine en ajoutant environ deux millilitres de chlorure de méthylène à la résine. Agitez pendant 30 secondes à une minute, puis égouttez. Répétez ce processus quatre fois avec du DCM, puis lavez la résine cinq fois avec de la diméthylformamide.

Pour effectuer la déprotection profonde du premier acide aminé bis et la capping simultanée de la résine, ajouter lentement deux millilitres d'une solution contenant 33 % de bromure d'hydrogène dans l'acide acétique et du DCM au récipient de réaction. Laisser agiter pendant 15 minutes après avoir drainé et lavé la résine cinq fois avec du DCM. Répéter la séquence de déprotection D une fois de plus.

Ensuite, lavez la résine cinq fois dans du DCM, puis cinq fois dans du DMF, neutralisez la résine en effectuant deux lavages avec une solution à 5 % volume/volume de D-I-P-E-A dans le DMF. Puis lavez cinq fois avec du DCM et cinq fois supplémentaires avec du DMF. À présent, le couplage de l'acide bis-aminé fonctionnalisé protégé peut être réalisé.

Tout d'abord, rétablir une atmosphère inerte dans le récipient de réaction contenant la résine en effectuant trois lavages avec du DCM anhydre. Ensuite, fixer un septum et purger le récipient à l'argon en y ajoutant un à deux millilitres de DCM anhydre, puis en agitant pendant 30 secondes. Puis vider le récipient jusqu'à ce que le barboteur de la ligne d'argon commence à monter.

Répétez ce processus au moins une fois supplémentaire. Ensuite, préparez une solution d'acide bis-aminé fonctionnalisé dans un tube à essai séché à la flamme sous atmosphère d'argon. Ajoutez 47 microlitres de DIC et agitez pendant 90 minutes.

Ensuite, ajouter 35 microlitres de D-I-P-E-A dans 666 microlitres de DMF hydraté sur la résine et agiter pendant cinq minutes supplémentaires. Transférer la solution d'acide aminé BIS pré-activée dans le récipient à l’aide d’une seringue et agiter toute la nuit le jour suivant. Éliminer le mélange réactionnel et laver deux fois avec du DCM anhydre sous argon.

Une étape cruciale de cette procédure est la couplage des acides aminés biz. Afin de garantir la formation des cycles de di-kétopipérazine, nous utilisons des durées de réaction plus longues avec des agents activateurs supplémentaires. Pour favoriser la fermeture du cycle de di-kétopyrazine, ajoutez une solution d'HOAT et de DIC, puis agitez sous argon pendant une heure.

Ensuite, retirez le septum et éliminez le mélange réactionnel. Lavez la résine cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF. Cette section décrit la protection profonde de l'acide aminé BIS fonctionnalisé, la protection profonde de F moc et l'acylation du premier acide aminé BIS.

Pour effectuer la déprotection profonde de l'acide aminé bifonctionnalisé protégé, ajouter lentement deux millilitres d'une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) et de TIPS au réacteur et agiter pendant une heure après avoir vidé. Laver la résine avec du DCM pendant environ 30 secondes, puis vider ; répéter ce lavage au DCM cinq fois. Ensuite, répéter toute la séquence de lavage de la résine de déprotection profonde selon le protocole de lavage A-D-C-M-D-M-F. Neutraliser la résine en la lavant deux fois avec une solution de D-I-P-E-A à 5 % volume/volume dans le DMF.

Effectuez ensuite un autre lavage D-C-M-D-M-F. À partir de ce stade, le peptide BIS peut être allongé avec d'autres acides aminés bis fonctionnalisés ou fonctionnalisé au niveau de l'acide carboxylique du groupe azoté en tête de chaîne, ou les deux. Pour déprotéger le groupe FM, ajoutez une solution de deux millilitres de pipéridine à 20 % dans le DMF et mélangez la réaction pendant 20 minutes.

Égouttez et lavez la résine cinq fois dans du DMF. Répétez ce processus une fois supplémentaire après un lavage additionnel de la résine. Isolez le premier bis-acide aminé en ajoutant la solution d'acide aminé préparée au récipient de réaction et en agitant pendant six heures comme étape finale.

Lavez la résine cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF. La dernière étape de ce protocole comprend l’élimination du groupe Bach de l’acide aminé lié à la résine et le clivage de la résine. Ajoutez d’abord deux millilitres d’une solution T-F-A-D-C-M à un pour un dans le récipient de réaction et agitez pendant 30 minutes.

Égoutter et laver la résine cinq fois dans du DCM. Répéter ensuite ce processus une fois de plus. Laver et égoutter la résine pendant 30 secondes, cinq fois avec du DCM et cinq fois avec du DMF.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d'une solution de 10 % D-I-P-E-A dans du DMF anhydre et agitez pendant 24 à 48 heures. Enfin, récupérez le mélange réactionnel dans un ballon rond préalablement pesé. Transférez 30 microlitres de cette solution dans 450 microlitres de tétrahydroFU dans un fichier LC-MS et soumettez-le à l'analyse.

Lavez la résine avec des aliquotes supplémentaires de DMF et recueillez dans l’erlenmeyer. Les méthodes suivantes peuvent être utilisées pour surveiller les transformations chimiques sur la résine tout au long de la synthèse. Pour détecter les groupes hydroxyle libres, effectuez le test au rouge de méthyle en prélevant d’abord environ un milligramme de résine sèche à l’aide d’une pipette jetable.

Rincer dans un récipient réactionnel de quatre millilitres. Ajouter une solution de rouge de méthyle préparée comme décrit dans le texte et agiter pendant cinq à dix minutes. Éliminer le liquide et laver la résine cinq fois avec du DCM ; des billes de résine orange ou rouge indiquent la présence de groupes hydroxyle libres.

Ce test peut être utilisé pour évaluer le chargement du premier acide aminé bis et les étapes de bouchage de la résine. Pour détecter les amines secondaires, effectuez le test au chloral en transférant environ un milligramme de résine sèche dans un petit flacon à l’aide d’une pipette jetable. Ajoutez trois gouttes de solution de chloral 0,8 millimolaire dans le DMF et trois gouttes de solution d’aldéhyde acide à 2 % dans le DMF.

Et laissons à température ambiante pendant cinq à dix minutes. Dans ce cas, la présence de billes de résine bleues ou violettes indique que des amines secondaires libres sont présentes sur le composé lié à la résine. Pour confirmer l'efficacité d'activation, effectuez le test de piégeage d'activation : le composé activé au cours de la synthèse peut être évalué en transférant cinq à dix microlitres de la solution activée dans un flacon de chromatographie liquide-spectrométrie de masse contenant 50 microlitres d'oléine, puis en mélangeant manuellement.

Pendant quelques secondes, la solution doit devenir jaune, puis être diluée avec 450 microlitres de tétrahydrofurane et analysée par LC-MS. Le produit final et les intermédiaires activés peuvent être évalués à l'aide d'un système LCM S équipé d'une colonne en phase inverse C 18 et d'un système de solvants composé d'eau, d'acétonitrile et de 0,1 % d'acide formique. Ce chromatogramme L-C-M-S-U-V illustre un exemple de la bonne pureté du produit brut.

Le pic principal du spectre observé à 21,3 minutes présente un masque compatible avec la masse attendue du produit. Cela peut être visualisé sur le spectre de masse du produit brut, où l'on observe des pics principaux correspondant à la masse elle-même, à la masse augmentée de celle de l'ion sodium, ainsi qu'à la masse diminuée de celle du groupe protecteur IV DDE. On voit ici le tracé UV de la CLSM des spectres purifiés, révélant un produit très pur à 21,3 minutes, et le spectre de masse confirmant l'identité de ce pic trier purifié.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser les techniques de synthèse en phase solide pour préparer des bis peptides fonctionnalisés après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des bis peptides pour explorer des applications dans les interactions protéine-protéine et la catalyse, une fois maîtrisée. Cette technique peut permettre la synthèse d’un trimère de bis peptide fonctionnalisé en quatre à cinq jours, si elle est correctement réalisée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à maintenir les billes immergées dans les solutions de réaction et de lavage en suivant ce protocole. D'autres méthodes, telles que la synthèse parallèle ou la synthèse de bibliothèques, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme l'effet de la stéréochimie ou de fonctions alternatives sur la liaison aux protéines ou l'activité catalytique. N'oubliez pas que l'utilisation de réactifs organiques peut être extrêmement dangereuse et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle adaptés et le travail sous hotte aspirante, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.