Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l'activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

L'objectif général de cette procédure est de mesurer le sommeil défini par EEG et la concentration de lactate pendant une stimulation optogénétique à des coordonnées stéréotaxiques précises. Implanter chirurgicalement les électrodes électroencéphalographiques nécessaires ainsi que les canules pour un capteur de lactate et un câble d'optique. Ensuite, insérer le câble d'optique et le capteur de lactate préalablement étalonné dans leurs canules guide situées dans le crâne de l'animal.

Ensuite, ajustez l'intensité du stimulus lumineux bleu afin d'obtenir la réponse électrophysiologique souhaitée. Puis, procédez à la collecte des données d'électroencéphalographie, d'électromyographie et de concentration en lactate pendant que l'animal est autorisé à se comporter spontanément ou à dormir. Par rapport à d'autres méthodes telles que les études pharmacologiques de l'EEG, cette approche expérimentale présente l'avantage de surveiller la biochimie cérébrale et l'électrophysiologie tout en manipulant en temps réel, à l'échelle du dixième de seconde, l'activité des neurones.

Ainsi, le potentiel de fournir de nouvelles perspectives pour le domaine de la recherche sur le sommeil est élevé. Par exemple, on peut identifier les corrélats métaboliques et électrophysiologiques du sommeil lent. Ce type d'expérience peut également être appliqué à d'autres domaines des neurosciences, tels que l'apprentissage et la mémoire, la plasticité synaptique ou les troubles épileptiques.

La technique chirurgicale est techniquement difficile. Elle exige une grande habileté, qui peut toutefois être acquise par la pratique. Dans cette démonstration visuelle, je détaillerai les étapes essentielles de certaines procédures chirurgicales complexes, en complément de la description écrite.

Une fois que l'animal s'est remis de l'intervention chirurgicale, le défi consiste à insérer correctement le capteur de lactate et le câble en fibre optique. Jonathan et moi allons montrer comment utiliser une main ferme pour maintenir l'animal lors de l'insertion de ces deux éléments délicats. Enfin, nous montrerons comment optimiser la réponse EEG en ajustant en temps réel l'intensité du stimulus.

Pour cette expérience, utilisez des souris transgéniques exprimant le canal cationique sensible à la lumière bleue. Le canal s'exprime dans deux types de neurones du cortex cérébral. Anesthésiez d'abord la souris à l'aide de 5 % d'isoflurane, 95 % d'oxygène pour l'induction, tout en maintenant l'anesthésie avec 3 % d'isoflurane, 97 % d'oxygène.

Réalisez une incision médiane sur le dessus du crâne, de l’espace entre les yeux jusqu’à l’arrière du crâne. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d’hydrogène et de la solution saline stérile. Localisez et marquez les points B et Lambda afin de déterminer les coordonnées stéréotaxiques pour les configurations de stimulation optogénétique par électrode, puis préparez les trous pour les vis à l’aide d’une fraise dentaire à grande vitesse équipée d’abord d’un embout sphérique de 0,5 millimètre, puis d’un embout sphérique de 0,7 millimètre.

Insérez les vis à électrode de un gramme dans les trous à l’aide d’un tournevis plat. Vissez-les d’environ quatre à cinq tours pour obtenir la profondeur souhaitée. Maintenez les canules de guidage en place à l’aide d’une canule stéréotaxique, puis fixez-les au crâne et aux ancres avec du ciment acrylique. Pour préserver la perméabilité, chaque canule de guidage doit être équipée d’une canule factice ou d’un stylet du moment de la chirurgie jusqu’au moment de l’expérimentation.

Une fois les EEG et les canules-guide positionnés dans le crâne, les fixer ensemble à l’aide d’une fine couche de ciment acrylique dentaire. Après la prise du ciment, positionner le connecteur en plastique au-dessus du monticule de ciment séché, en soudant aux extrémités des fils provenant des électrodes EEG les contacts sur le connecteur en plastique, au cas où les fils seraient intégrés au ciment. Ensuite, faire passer les fils de l’électromyogramme à travers les muscles nucléaires en les glissant dans le tube d’une aiguille de calibre 21.

Traverser le muscle et faire un nœud chirurgical double avec un fil de nylon 5-0 autour de ces fils, juste en position distale à l'endroit où ils sortent du muscle. Refermer ensemble la peau qui avait été rétractée pour accéder au tissu musculaire à l’aide de points chirurgicaux simples interrompus, en utilisant une aiguille P-3 à bord tranchant inversé et un fil de nylon 5-0. Une fois l’unité de stimulation mc programmée, la faire fonctionner en tant que générateur de signal autonome produisant un signal binaire marche-arrêt de cinq volts. Connecter l’unité de stimulation mc à l’unité d’alimentation du laser activée TTL à l’aide de connecteurs BNC.

Connectez l'unité d'alimentation du laser au laser à l'aide d'un câble ruban. Connectez également le laser au connecteur FC mâle du câble de raccordement en fibre optique d'origine. Branchez le câble en fibre optique d'origine au joint tournant.

L'adaptateur rotatif à fibre optique sert de collecteur. Lorsque l'animal se déplace dans sa cage, l'adaptateur rotatif tourne afin d'éviter la rupture des câbles en fibre optique due au couple de rotation. Fixez le collecteur à un support métallique placé au-dessus de la cage cylindrique dans laquelle l'animal est logé à l'aide de colliers en plastique.

Immobilisez la souris en utilisant une main pour la maintenir sous une paume recourbée. Orientez la tête entre le majeur et l'index de l'expérimentateur. Nettoyez maintenant la canule-guide de tout débris, à l'aide d'une aiguille stérile de calibre 25.

Insérez ensuite le câble en fibre optique à la main et fixez-le à la canule de guidage pour fibre optique à l’aide d’un bouchon fileté. Contrôlez la profondeur d’insertion du câble en fibre optique dans le cerveau à l’aide d’un nœud de suture fait sur le câble à une distance fixe de son extrémité plate clivée. Le capteur est équilibré dans une solution saline tamponnée au phosphate et exposé successivement à trois concentrations de L-lactate de manière progressive.

Suivant les protocoles du fabricant, insérez le capteur préalablement étalonné dans la canule-guide pour lactate fixée au crâne, de la même manière que pour l'insertion du câble en fibre optique. Connectez le capteur de lactate au préamplificateur du biosenseur Pinnacle 8, 400 à l’aide de connecteurs bipolaires. Ensuite, fixez ce préamplificateur au connecteur à huit broches du support cranien implanté chirurgicalement.

Avant de recueillir les données, utilisez le bouton de réglage de l'intensité laser pour ajuster l'intensité du stimulus optogénétique. L'amplitude de la réponse EEG varie d'un animal à l'autre en raison de facteurs qui n'ont pas été étudiés de manière systématique. Il est donc nécessaire d'ajuster l'intensité du stimulus optogénétique et de vérifier que la réponse EEG est adéquate une fois la réponse souhaitée obtenue.

Collectez les données à l'aide du système Pinnacle 8, 400 avec le neuro score. Une interface SEIA classe les états de sommeil par inspection visuelle des données EEG et EMG traitées. Les données sont enregistrées par périodes de dix secondes comme étant éveil, sommeil non paradoxal ou sommeil paradoxal, selon l'EEG et l'EMG.

Cette configuration de stimulation optogénétique du biosenseur montre les électrodes EEG implantées chirurgicalement, le capteur de lactate et la canule destinée à la stimulation optogénétique. En l'absence de stimulation optogénétique, cette souris a présenté un sommeil spontané. Les transitions entre états d'éveil ont été enregistrées simultanément aux signaux EEG-EMG et à la concentration cérébrale de lactate, pendant l'éveil et les deux sous-types de sommeil.

Le mouvement oculaire rapide et le mouvement oculaire non rapide sont définis en fonction de l'EEG et de l'EMG. Fait intéressant, le courant du biocapteur de lactate augmente en fonction d'un EEG de faible amplitude et diminue en fonction d'un EEG de forte amplitude. Les deux canaux de l'EEG répondent aux stimuli optogénétiques délivrés dans le cortex frontal.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment implanter chirurgicalement une souris afin de réaliser simultanément une manipulation optogénétique et la mesure de l'électroencéphalogramme, de l'électromyogramme et de la concentration en lactate dans le cerveau. Une fois maîtrisée, cette technique chirurgicale peut être correctement réalisée en 90 à 120 minutes. N'oubliez pas de surveiller constamment la respiration de l'animal comme indicateur de la profondeur de l'anesthésie.

Si l'animal respire moins fréquemment qu'une fois toutes les quatre à cinq secondes, l'anesthésie pourrait être trop profonde. Si l'animal respire plus fréquemment qu'une fois toutes les deux secondes, l'anesthésie pourrait être trop légère. N'oubliez pas de prendre les précautions de sécurité appropriées lors de l'utilisation de l'agent anesthésique gazeux isoflurane.

Assurez une ventilation adéquate dans la salle chirurgicale afin de protéger votre rétine contre le laser utilisé pour la stimulation optogénétique. Portez soit des lunettes de protection, soit enfermez l'animal dans un caisson étanche à la lumière. Vous devrez vous entraîner à implanter le biocapteur de lactate et le câble en fibre optique chez une souris complètement éveillée.

Les souris ne se conforment pas à ces procédures et doivent être immobilisées. Toutefois, la contention ne doit pas être si forte qu'elle blesse l'animal ou empêche la respiration.