Suivi des réduction et par oxydation demi-réactions d'une monooxygénase flavine-dépendante à l'aide Stopped-Flow Spectrophotométrie

Cette procédure utilise un appareil de flux arrêté pour détecter les différentes formes spectrales de SID A et mesurer les vitesses. La réaction catalysée par SID A peut être divisée en demi-réactions réductrice et oxydative du FAD. Le flavine oxydé se lie au N-A-D-P-H et réagit pour former du flavine réduit et du NADP plus ; la réaction avec l'oxygène moléculaire et la liaison de l'ornithine conduisent à la formation du C quatre.

Une flavine hydroxylée après hydroxylation de l'ornithine, la flavine hydroxylée se déshydrate pour former l'enzyme oxydée. Le NADP⁺ reste lié tout au long du cycle catalytique et est le dernier substrat à être libéré. L'appareil à flux arrêté permet le mélange rapide de petits volumes de réactifs et l'enregistrement.

Les changements spectraux dans le temps permettent à un spectrophotomètre à faisceau divisé de mesurer la vitesse de formation et de disparition de réactions enzymatiquement catalysées, en particulier celle d'intermédiaires transitoires. Deux membres de mon laboratoire, Rita Robinson et Enviro Romero, démontreront ces expériences en utilisant la flavine mono-oxygénase comme système modèle. Versez 250 millilitres de tampon phosphate de potassium 100 millimolaire dans un ballon Büchner de 500 millilitres contenant un barreau aimanté.

Sceller le flacon avec un bouchon en caoutchouc, puis le placer sur une plaque d'agitation et relier le tube court du flacon à une ligne Schlenk. Désoxygéner le tampon sous vide pendant une heure à température ambiante avec agitation, puis purger avec de l'argon. Répéter l'opération cinq fois.

Enfin, rincer le ballon avec de l'argon pendant 10 secondes. Détacher le ballon du système sous vide et le placer à l'intérieur de la boîte à gants. Continuer à agiter vigoureusement avec le ballon ouvert.

Remplissez les seringues du réservoir avec une solution contenant 18,13 unités par millilitre de glucose oxydase et une solution de glucose à 100 millimolaire. Placez maintenant les vannes d'entraînement en position de chargement. Remplissez les seringues d'entraînement.

Ensuite, tournez le robinet F en position d'entraînement. À l'aide du logiciel de commande Pro Data, cliquez sur « vider la seringue d'arrêt », puis poussez le tampon provenant de la seringue d'entraînement F à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Poursuivez avec les trois autres seringues d'entraînement en les équilibrant pendant une heure.

Remplissez à nouveau les seringues du réservoir et répétez le rinçage du système en flux arrêté. Pour préparer le tampon saturé en oxygène, faites barboter la solution avec 100 % d’oxygène pendant une heure sous agitation.

Ensuite, retirez l'aiguille courte du flacon et attendez 10 secondes. Puis retirez l'aiguille longue et placez le flacon fermé dans la boîte à gants. Pour la solution de N-A-D-P-H.

Placer un tube Eppendorf de 1,5 millilitre contenant un milligramme de N-A-D-P-H dans la boîte à gants. Dissoudre dans 300 microlitres de tampon phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire. pH 7,5.

Prélèvez 30 microlitres pour déterminer la concentration de NADPH. Pour éliminer l'oxygène du stock d'enzyme, transférez la solution dans un flacon de 25 millilitres contenant une barre d'agitation, un bouchon avec joint en caoutchouc et un scellé en aluminium. Placez sur de la glace.

Connectez-vous à une ligne Schlenk, puis dégazez sous vide pendant 20 minutes, suivis d'un rinçage à l'argon. Enfin, rincez le flacon à l'argon pendant 10 secondes et déconnectez-le du collecteur sous vide. Placez le flacon sur de la glace à l'intérieur de la boîte à gants.

Dans la fenêtre du panneau de contrôle du logiciel de gestion Pro Data, sélectionnez le réseau de photodiodes, le déclenchement externe et l'échelle logarithmique. Lancez également le logiciel Pro Data Viewer et définissez le répertoire de stockage des fichiers de données.

Remplacez maintenant la solution dans les seringues réservoir C et F par un tampon de phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire, pH 7,5. Placez les vannes C et F en position d'entraînement. Cliquez sur « vider la seringue d'arrêt » dans le logiciel de contrôle Pro Data.

Ensuite, poussez le tampon à partir des deux seringues d'entraînement à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Répétez le rinçage avec les seringues de réservoir C et F encore trois fois. Pour garantir l'élimination complète de la glucose oxydase du circuit d'écoulement, procédez en cliquant sur « baseline » dans le logiciel de contrôle des données pro.

Remplacez la solution du réservoir de la seringue F par la solution d'enzyme. Tournez le robinet F en position d'entraînement. Cliquez sur « vider la seringue d'arrêt » dans le logiciel de contrôle Pro Data.

Poussez la solution enzymatique du piston d'entraînement F à travers le circuit de flux en soulevant manuellement le piston d'entraînement correspondant. Revenez au logiciel de contrôle des données pro pour régler le temps d'acquisition à 60 secondes. Vérifiez que les deux seringues d'entraînement sont remplies avec leurs solutions respectives et que les pistons d'entraînement sont en contact avec les pistons des seringues d'entraînement.

Placer les deux vannes en position d'entraînement et cliquer sur acquérir dans le logiciel de contrôle Pro Data pour effectuer l'essai. Acquérir les données spectrales de la forme oxydée de l'enzyme en triple exemplaire en utilisant la valeur A 4 52 nanomètres obtenue lors des essais. Déterminer la concentration de l'enzyme avant mélange et préparer quatre millilitres de solution de N-A-D-P-H.

Remplissez la seringue de réservoir C avec une solution de N-A-D-P-H 1,5 fois plus concentrée, puis videz et remplissez à nouveau la seringue d'arrêt trois fois, comme indiqué précédemment. Ensuite, enregistrez les spectres pendant la réduction de l'enzyme, en rinçant le contenu du circuit d'écoulement avec un tampon phosphate de potassium anaérobie 100 millimolaire, pH 7,5. Cliquez maintenant sur « baseline » dans le logiciel de contrôle des données Pro.

Ensuite, mélanger 200 microlitres de solution mère d'enzyme avec 1000 microlitres de tampon phosphate de potassium anaérobie à 100 millimolaire, pH 7,5. Remplacer la solution dans la seringue réservoir A par la solution d'enzyme.

Placer la vanne A en position d'entraînement dans le logiciel de contrôle Pro Data. Cliquer sur « Arrêter la seringue vide ». Pousser la solution d'enzyme depuis la seringue d'entraînement A à travers le circuit d'écoulement en relevant manuellement le piston d'entraînement correspondant.

Régler le temps de délai sur 0,5 seconde et le temps d'acquisition sur 60 secondes. Vérifier que toutes les seringues d'entraînement sont remplies avec leurs solutions respectives et que les tiges d'entraînement sont en contact avec les pistons des seringues d'entraînement. Ensuite, placer toutes les valves d'entraînement en position d'entraînement et cliquer sur acquérir dans le logiciel de contrôle des données pro.

Obtenez des données spectrales de la forme oxydée de l'enzyme en triple exemplaire. Ensuite, remplacez la solution de la seringue réservoir B par une solution de N-A-D-P-H, 1,5 fois plus concentrée que la solution d'enzyme dans la seringue A. Placez la vanne B en position d'entraînement et videz puis remplissez à nouveau la seringue d'arrêt trois fois, comme indiqué précédemment dans la fenêtre du panneau de contrôle.

Régler le temps de délai à 0,5 seconde. Après une acquisition de 20 secondes, remplacer la solution dans la seringue réservoir par du tampon oxygéné. Placer la vanne C en position d'entraînement.

Effectuez trois rinçages dans le logiciel de contrôle pro data. Réglez le temps de délai à 15 secondes et le temps d'acquisition à 900 secondes. Poursuivez l'acquisition des spectres pendant la réoxydation de l'enzyme entièrement réduite dans l'appareil à arrêt d'écoulement.

La réduction anaérobie de SID A avec le N-A-D-P-H peut être suivie en mesurant les variations de l'état rédox du flavine par absorption à 452 nm. Les changements spectraux sont enregistrés au cours du temps, depuis la forme oxydée de SID A jusqu'au spectre final de SID A entièrement réduit. La vitesse de cette étape enzymatique peut être déterminée en ajustant les données à l'équation appropriée. La vitesse d'oxydation et les intermédiaires réactionnels peuvent également être déterminées en utilisant le mode de mélange double du système d'arrêt d'écoulement dans cette réaction par AF Sid A. L'intermédiaire hydroxyflavine C quatre A est clairement détecté avec un lambda max à 380 nanomètres, tandis que l'enzyme oxydée présente un lambda max à 450 nanomètres.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas de vous assurer que les solutions sont anaérobies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier à la fois l'ion relatif et l'ion ulcératif de la FLA indépendante, en vue d'expériences ultérieures comme la chimie rapide.

Quentin peut aider à élucider la nature triste des intermédiaires.