Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

L'objectif général de l'expérience suivante est de différencier des cellules souches pluripotentes humaines, ou CSPH, en neurones en utilisant un format de plaque multi-puits. Ceci est réalisé en récoltant et en ensemencant une suspension monocellulaire de CSPH dans des plaques 96 puits en fond V afin de former des corps embryonnaires, ou CE, durant la nuit.

Ensuite, les EB sont transférés dans des plaques ultra-faible adhérence en forme de U contenant un milieu de différenciation afin d'induire la formation du neuroectoderme. Par la suite, les EB sont ensemencés dans des boîtes revêtues de matrigel pour favoriser l'expansion des neurones. Des résultats peuvent être obtenus montrant la présence de marqueurs neuronaux typiques vers le huitième jour par immunofluorescence.

Les protocoles de coloration pour différencier les cellules souches humaines pluripotentes en neurones sont souvent compliqués et fastidieux. Quelque peu par hasard, nous avons découvert une procédure très simple permettant d'obtenir des neurones à partir de cellules souches humaines pluripotentes.

D'un point de vue technique, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa facilité de mise en œuvre, sa rapidité et son efficacité économique. En même temps, la présentation de la procédure sera assurée par le Dr MI Z du laboratoire. Préparez le milieu de formation des corps embryonnaires et le milieu de différenciation selon les instructions du protocole écrit.

Cultivez les CPSh en conditions sans cellules nourricières, par exemple dans un milieu conditionné au méthanol sur des plaques revêtues de Matrigel, ou en utilisant des systèmes de culture chimiquement définis, en conditions de croissance active et sous-confluentes. À l’aide d’un microscope stéréo et d’une micropipette stérile en plastique, retirez mécaniquement les colonies différenciées spontanément. Lavez les colonies indifférenciées restantes avec du PBS et utilisez de l’Accutase contenant un inhibiteur ROCK à 1 x pour digérer les cellules en cellules uniques.

Centrifuger les cellules individuelles à 200 G pendant deux minutes et les resuspendre dans un petit volume de milieu de formation d'embryocorps. Utiliser un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire. Ajouter des cellules supplémentaires au milieu restant de formation d'embryocorps afin d'obtenir une concentration comprise entre 40 000 et 80 000 cellules par millilitre.

À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 100 microlitres par puits vers une plaque 96 à fond en V, afin d’obtenir entre 4 000 et 8 000 cellules par puits. Faire centrifuger la plaque dans une centrifugeuse à rotor oscillant à 400 ×g pendant une minute afin de regrouper toutes les cellules au fond des puits. Transférer les cellules dans un incubateur et laisser les EBS se former durant la nuit, puis observer le lendemain au microscope stéréoscopique.

Prélevez le SEB et transférez-le en petit volume dans une boîte bactériologique de 3,5 centimètres contenant deux millilitres de milieu de différenciation. Lavez les cellules en faisant tourner doucement la boîte. Ajoutez 100 microlitres de milieu de différenciation dans chaque puits d'une plaque à attachement ultra faible.

Plaque 96 puits en bas sous un microscope stéréo. Transférez l'EBS en petits volumes depuis la coupelle de lavage vers les puits 96 en U. Incubez l'EBS pendant quatre jours afin de permettre la formation de neuroectoderme le quatrième jour.

Lavez les cellules dans le milieu de différenciation et ensemencez-les individuellement dans les puits d'une plaque multi-puits revêtue de matrigel, comme une plaque 12 puits. Les cellules doivent être uniformément réparties dans les puits afin de permettre une expansion non perturbée des neurones. Laissez les EBS s'attacher légèrement au matrigel pendant environ 10 minutes à température ambiante.

Transférez ensuite délicatement la plaque dans l'incubateur. Les neurones se développeront à partir des EBS ensemencés de manière radiale au cours des quatre prochains jours. Précédemment, nous avons montré qu'en accord avec de nombreuses autres études, les EBS à partir de CSPH pouvaient être générés simplement par réensemencement d'agrégats lors de la division routinière des CSPH dans des boîtes à faible attachement.

Cela donne généralement lieu à une large distribution des tailles cellulaires. Un autre problème est que les EBS maintenus en suspension ont tendance à s'agréger entre eux, ce qui entraîne une hétérogénéité de taille encore plus importante. Pour éviter cela, des PSC-H uniques ont été ensemencés dans des puits à faible attachement, ce qui a entraîné l'absence de formation d'EBS et une mort cellulaire. Toutefois, la combinaison de la molécule favorisant la survie cellulaire, Y 2 7 6 3 2, avec de l'alcool polyvinylique, qui a montré une amélioration de la formation d'EBS à partir de CSH, a permis la formation d'EBS à partir de suspensions de cellules souches embryonnaires humaines uniques en une nuit.

De manière pratique, la taille des corps embryonnaires (EB) dans ce format de plaque multi-puits pouvait être rigoureusement contrôlée en semant des nombres variables de cellules par puits. Contrairement aux techniques conventionnelles, après le transfert des EB dans des plaques 96 U à attachement ultra-faible, la formation du neuroectoderme a été induite à l’aide d’un mélange de petites molécules composé d’inhibiteurs de F-G-F-E-R-K-T-G, de TGF beta SMA deux et de BP SMA un, permettant ainsi aux cellules d’être ensemencées sur de la matrigel pour donner naissance à des neurones. L’initiation de la formation des EB à partir d’environ 8 000 cellules a produit la meilleure capacité de différenciation neuronale, caractérisée par des prolongements neuronaux marqués émanant des EB ensemencés.

Centres nécrotiques réduits des corps embryonnaires après ensemencement et forte expression de marqueurs sensoriels et pan-neuronaux tels que B rrn three A et bêta trois tubuline. Les rendements globaux de différenciation neuronale semblent comparables à ceux de la procédure initiale, applicable jusqu'à présent aux deux types de cellules, HSC et HI PSC. Trois lignées indépendantes de HPSC, y compris des cellules HES et HIPS, ont été testées avec succès selon la méthode en multi-puits, bien que des variations liées à la lignée cellulaire et des différences de rendement de différenciation ne puissent généralement pas être exclues.

Cette figure montre des cellules neuroectodermiques dissociées du jour quatre, semées en tant que cellules individuelles et correctement différenciées avec une efficacité d'environ 60 %. La manipulation des EBS dans la plateforme multi-puits nécessite un peu d'entraînement au départ, mais après un certain temps, vous verrez que c'est assez facile.