Do-It-Yourself dispositif de récupération d'échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

L'objectif de cette procédure est de faciliter la récupération d'échantillons dans des boîtes cryogéniques et des cryotubes à partir de cuves doubles remplies d'azote liquide, à l'aide d'un dispositif facile à construire. Cela est réalisé en retirant d'abord un ou deux bacs congélateurs de la cuve pour permettre des manœuvres et insérer verticalement le dispositif dans la cuve. La deuxième étape consiste à gratter délicatement le fond de la cuve avec le dispositif.

Ensuite, remontez verticalement l'appareil le long des parois du congélateur. Pour sortir la boîte congélation du réservoir, la dernière étape consiste à saisir la boîte récupérée au fond du congélateur et à remettre en place les clayettes de congélation retirées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le décantation ou la barre pleine d'azote liquide, est qu'elle offre une alternative facile, sûre et rapide, préservant l'intégrité des échantillons et pouvant être réalisée par un seul opérateur. Pour commencer l'assemblage du dispositif cryo-résistant, utilisez une pince pour redresser un côté d'une agrafe solide à trois côtés afin de former une agrafe solide en forme de L.

Comme on le voit ici, les dimensions de l'attache résistante peuvent être choisies en fonction du diamètre du col du manipulateur. Deux attaches résistantes de ce type doivent être réalisées afin de permettre à l'appareil de récupérer des boîtes cryogéniques de cinq pouces et demi sur cinq pouces et demi. Fixez-les à l'aide d'une sangle d'attache résistante TST, d'un boulon à couronne, d'une rondelle et d'une vis afin de former la base de la pelle cryogénique.

Le dispositif doit maintenant apparaître comme illustré ici. À l’aide d’une plaque ajourée, alignez les fentes de la sangle en T Strong Tie avec les fentes situées à une extrémité de la plaque ajourée. Ensuite, fixez solidement les deux éléments ensemble à l’aide d’écrous et de boulons Hillman.

Percez des trous pour la fixation si la plaque rainurée et les attaches métalliques n'ont pas de trous pré-percés. Si désiré, une poignée peut être formée en courbant l'autre extrémité de la plaque rainurée et en l'enroulant avec de la mousse. Pour mieux saisir l'appareil, veillez à retirer la mousse avant l'immersion dans l'eau.

L'appareil de récupération bricolage tolérant au cryo peut également être adapté pour la récupération de cryotubes. Cela consiste à remplacer la base plate par un tamis en acier inoxydable modifié pour permettre la cueillette des tubes depuis un liquide. Pour commencer le montage, commencez par dévisser les écrous et boulons de la couronne, puis fixez la sangle solide en forme de T à la plaque rainurée.

Ensuite, avant d'attacher le tamis en acier inoxydable à la plaque fendue, courber délicatement le col du tamis à l'aide d'une pince afin d'orienter la base selon un angle qui le fasse ressembler à une louche. Si le tamis utilisé est muni d'un rebord, utiliser la pince pour courber ce rebord vers le bas. Cela facilitera les manœuvres avec l'appareil.

Aligner le trou sur la poignée du tamis avec les trous sur la plaque cannelée et fixer le tamis à l’aide d’écrous et de boulons Hillman. Percez des trous si le tamis ne comporte pas de trous pré-percés. Pour commencer à retirer des boîtes cryogéniques d’un doer, assurez-vous d’abord d’enfiler des gants cryogéniques.

Ensuite, retirez une ou deux clayettes du congélateur pour dégager de l'espace afin de manœuvrer facilement avec l'appareil. Puis, utilisez le dispositif de récupération bricolé, résistant au froid et maintenu verticalement, équipé d'une base solide en lien ttra, pour gratter doucement le fond du congélateur et récupérer la boîte tombée au fond du réservoir. Ensuite, remontez verticalement l'appareil le long des parois du congélateur afin de ramasser la boîte hors du réservoir.

Remarquez que l'appareil doit être tenu verticalement et tiré vers le haut en ligne droite afin d'éviter que la boîte ne glisse à nouveau dans le doer. Pour récupérer les cryotubes, utilisez la cuillère cryogénique équipée d'un tamis afin de gratter doucement le fond du doer, de manière similaire à la récupération des boîtes cryogéniques, remontez ensuite l'appareil à la verticale et saisissez les tubes recueillis dans le tamis. Un défi majeur dans les études d'expression génique est que la qualité de l'ARN dépend des conditions de stockage, tant pour les échantillons tissulaires congelés que pour l'ARN extrait.

Cette figure illustre l'effet de la manipulation des échantillons sur l'intégrité de l'ARN total. L'ARN total provenant de la même source tissulaire a été soumis à différents traitements avant l'expérience. Un ARN total intact se caractérise par des bandes ribosomales 28 s et 18 s bien visibles, la bande 28 s étant environ deux fois plus intense que la bande 18 s. Ce profil indique que l'ARN est intact. Les pistes trois et quatre montrent des échantillons présentant une dégradation importante due à des décongélations partielles répétées lors de prélèvements à court terme à partir du congélateur, modélisant ainsi un stockage à long terme avec des prélèvements périodiques rendus nécessaires par la récupération de cryotubes tombés dans les boîtes.

Cependant, les échantillons conservés dans le service doer à l’aide du dispositif DIY et n’ayant donc subi aucune décongélation partielle contiennent de l’ARN intact dans la piste deux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment récupérer des échantillons du dvar rempli d’azote liquide sans avoir à le transvaser.