Un essai en phase liquide d'affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

Ce protocole exploite l'interaction entre le poliovirus et les nanocorps reconnaissant le poliovirus afin de démontrer un essai simple de capture d'affinité en phase liquide et quantitative. Des billes magnétiques revêtues de cobalt sont principalement utilisées pour précipiter les protéines marquées ainsi que toute protéine radioactive interagissant avec elles. Tout d'abord, mélangez les protéines marquées et étiquetées, puis incubez à température ambiante.

Ensuite, ajoutez des billes magnétiques qui reconnaissent la marque, séparez la fraction liée de la protéine marquée de la fraction non liée à l'aide d'aimants. Puis mesurez le signal de la protéine marquée présente dans la fraction non liée et déterminez la quantité de protéine marquée retrouvée dans la fraction non liée. Les résultats de ce test d'affinité en phase liquide sont extrêmement utiles lorsqu'on analyse des protéines sensibles à la conversion conformationnelle.

Ce dosage d'interaction par capture d'affinité en phase liquide peut fournir des informations sur l'interaction entre le poliovirus, les nano-anticorps reconnaissant le poliovirus et différents antigènes du poliovirus. La méthode peut également être appliquée à d'autres interactions protéine-protéine, à condition qu'une des protéines puisse être marquée et l'autre détectée. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous nous sommes intéressés à l'étude de l'interaction entre le poliovirus, les nano-anticorps reconnaissant le poliovirus et différents antigènes du poliovirus.

Étant donné que le poliovirus est sensible à la conversion conformationnelle lorsqu'il est fixé sur une surface solide, l'utilisation de l'ELSA est limitée. Un système en phase liquide devrait donc être privilégié. Un exemple de système en phase liquide fréquemment utilisé dans la recherche sur le poliovirus est le microprotéine.

Un test d'immunoprécipitation. Bien que ce test ait démontré son applicabilité, il nécessite la structure cristallisée d'un anticorps conventionnel, structure absente chez les nanocorps. Ces nanocorps, qui sont des anticorps monodomaines intéressants et très stables, peuvent être facilement modifiés par différents textes.

Le système His-tag très utilisé présente une affinité pour les ions bivalents, tels que le nickel et le cobalt, lesquels peuvent à leur tour être facilement fixés sur des billes magnétiques. Nous avons donc mis au point un dosage simple d'affinité quantitative basé sur des billes magnétiques revêtues de cobalt.

Vortexez le stock de billes magnétiques et transférez 10 microlitres pour chaque échantillon dans un tube. Faites précipiter les billes à l’aide d’un aimant. Éliminez le surnageant clair pour laver les billes. Ajoutez 150 microlitres de tampon de liaison.

Récupérez les billes à l’aide d’un aimant et éliminez le surnageant après un deuxième lavage. Resuspendez les billes dans 40 microlitres de tampon de liaison pour chaque échantillon à contrôler. Pour le fond dans l’échantillon un, préparez un puits sans virus radiomarqué, mais avec un volume égal de tampon de liaison comme témoin.

Échantillon deux d'une activité radioactive à 100 %. Ajouter tous les composants dans un puits, sauf remplacer le nanocorps par du tampon de liaison. Ajouter ensuite 2000 désintégrations par minute du poliovirus marqué au soufre 35, souche sept, type un, dans un volume total de 80 microlitres de tampon de liaison à tous les échantillons.

Accepter le témoin. Échantillon un. Ajouter 10 microlitres de dilution de nanocorps à chaque échantillon.

Mélanger soigneusement pendant 10 secondes sur un agitateur et incuber une heure à température ambiante. Ensuite, ajouter 40 microlitres de la suspension de billes magnétiques lavées et incuber 10 minutes à température ambiante sous agitation continue, rassembler les billes à l’aide d’un aimant et transférer le surnageant clarifié dans un tube afin de mesurer la radioactivité de chaque échantillon ; transférer 50 microlitres du surnageant dans un flacon de comptage. Ajouter trois millilitres de mélange de liquide de scintillation et lire sur ce compteur.

À l'aide d'eau, effectuez une contre-extraction des billes magnétiques utilisées dans un tube et centrifugez à 500 ×g pendant deux minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les billes dans six millilitres d'hydroxyde de sodium 0,5 molaire. Ensuite, aliquotez la suspension dans plusieurs tubes et incubez dans un bain ultrasonique pendant cinq minutes.

Après avoir mis en pellet les billes à l’aide d’un aimant et avoir retiré le surnageant, ajouter un millilitre de solution de SDS à 2 % dans chaque tube, puis mélanger par vortex et recouvrir de papier aluminium pendant cinq minutes. Récupérer maintenant les billes. Ajouter un millilitre de EDTA 0,2 M, pH 7, dans chaque tube, et incuber les tubes dans un bain ultrasonique pendant cinq minutes.

Ensuite, récupérez les billes, lavez-les avec un millilitre d'eau trois fois, puis avec un millilitre de solution de chlorure de cobalt à 10 millimolaire. Placez les tubes sur un agitateur pendant 10 minutes. Poursuivez en récupérant les billes sur un aimant et resuspendez-les dans un millilitre de tampon de liaison.

Laver deux fois dans un millilitre d’éthanol 20 %, puis resuspendre finalement les billes dans leur volume initial d’éthanol 20 % afin d’obtenir les billes régénérées à une concentration de 40 milligrammes par millilitre. Corriger la radioactivité de fond en définissant les témoins : échantillonner un comme valeur de 0 % de radioactivité et le témoin deux comme valeur de 100 % de radioactivité.

Maintenant, pour chaque échantillon, calculez le pourcentage de radioactivité dans le culot comme mesure de la précipitation globale du virus marqué au niveau du radio-isotope par le nanocorps. Cette expérience évalue l'affinité du nanocorps PVSS 38 C et d'un anticorps spécifique du poliovirus en utilisant trois antigènes différents du poliovirus : l'antigène natif, l'antigène chauffé et les sous-unités de 14 s. Fait intéressant, la radioactivité dans le culot des échantillons contenant les sous-unités de 14 s marquées au niveau du radio-isotope diminue avec l'augmentation des concentrations du nanocorps PVSS 38 C. Cela indique une augmentation de la quantité de sous-unités de 14 s du poliovirus liées au nanocorps PVSS 38 C, et indirectement aux billes magnétiques.

Étant donné qu'aucune affinité de pvs S 38 C pour la forme antigénique N et la forme antigénique H du poliovirus n'est observée, le nanocorps semble spécifique de la sous-unité 14 s du poliovirus. L'affinité du nanocorps envers ses antigènes, mesurée par cette méthode, est spécifique, contrairement au nanocorps non apparenté. NB un ne montre aucune réactivité contre les trois formes antigéniques du poliovirus.

Ce système offre une forte reproductibilité, comme indiqué par cette courbe de réponse à la dose générée par différents investigateurs à des jours différents. Une fois maîtrisé, cet essai fiable de capture par affinité en phase liquide peut être correctement réalisé en moins de deux heures, y compris le recyclage des billes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cet essai de capture par affinité en phase liquide basé sur des billes magnétiques pour étudier l'interaction entre différentes protéines, notamment lorsque des systèmes basés sur une phase solide ne peuvent pas être utilisés.