À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Dans cet article vidéo, nous décrivons un nouveau protocole hydro put pour la synthèse en phase liquide automatisée d'oligosaccharides et la fonctionnalisation de nanoparticules en poly anhydride. À l’aide de ces agents ciblants à base de glucides, des molécules de glucides sont d’abord synthétisées à l’aide d’un système automatisé utilisant la synthèse en phase liquide au lieu de synthétiseurs en phase solide. Ensuite, les intermédiaires d’oligosaccharides sont purifiés par extraction sur phase solide florissante, ou FSPE.

Les molécules de glucides produites sont caractérisées par RMN, puis fixées sur les nanoparticules de polyanhydride par conjugaison carbo IDE. Enfin, les nanoparticules fonctionnalisées par des glucides sont caractérisées par spectroscopie de photoélectrons X et par un dosage à l'acide phénol-sulfurique hydro putt. En définitive, grâce à la méthodologie hydro put décrite ici, les conditions réactionnelles permettant d'optimiser la morphologie des nanoparticules et la densité de glucides à la surface des particules ont été obtenues.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que la synthèse d'oligosaccharides sur support solide, réside dans l'utilisation d'une quantité nettement inférieure de blocs de construction. Dans cette méthode, on utilise typiquement deux à trois équivalents au lieu de 10 à 20 équivalents. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons démontré l'efficacité des effets de surface, par la fonctionnalisation de nanoparticules polyhydroxy, à l'aide de glucides ciblant les récepteurs ceep sur les cellules anti-dentition. Nous avons ensuite souhaité concevoir un système à haut débit qui nous permettrait d'analyser les multiples paramètres impliqués dans la fabrication et l'application de ces nouveaux vecteurs.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le développement de plateformes automatisées pour la synthèse à haut débit d'oligosaccharides et leur fixation sur des particules polymériques constitue un domaine de recherche nouveau, pour lequel peu de documentation est disponible avant la synthèse automatisée de l'acide dianoïque. Un donneur de sucre convenablement protégé, généralement du tri chloro acétamide, ainsi qu'un accepteur principalement en Alcon, de l'alcool fluoroaliphatique, sont synthétisés sur la paillasse et préparés dans du chlorométhane ; préparez également du triméthylsilo, du trifluorométhanesulfonate dans du chlorométhane, du méthanol à 80 % et du méthanol à 100 %. Veillez à ce que l'humidité relative dans la pièce soit inférieure ou égale à 30 % dans la chambre d'automatisation.

Une humidité élevée est néfaste aux réactions de glycosylation. Les étapes suivantes sont réalisées à l'aide d'une plateforme d'automatisation. La première glycosylation est effectuée avec le donneur et l'alcool floristique.

Une fois terminé, la molécule de sucre portant l'étiquette florale obtenue est purifiée par FSPE. Le groupe protecteur temporaire est ensuite éliminé à l'aide de méthoxyde de sodium et de méthanol, puis le produit est à nouveau purifié par FSPE. Ensuite, le sucre portant l'étiquette florale est utilisé comme accepteur et couplé au même donneur pour obtenir le disaccharide, lequel est purifié par FSPE pour commencer.

Placer les réactifs, y compris le donneur, l'accepteur, le promoteur, l'eau-méthanol à 80 %, le méthanol à 100 % et le méthylate de sodium, sur la plateforme robotisée, puis démarrer le programme. Le bras robotisé prélèvera le donneur puis l'accepteur dans les flacons et les transférera dans un flacon de réaction. Ensuite, le mélange de donneur et d'accepteur est agité pendant 30 minutes.

Une fois les 30 minutes écoulées, le bras robotique transfère le triméthylsiloyle catalytique, le trifluorométhanesulfonate, dans le mélange. La solution est ensuite agitée pendant 30 minutes supplémentaires. Une fois l'agitation terminée, le programme fait une pause.

Prélève un aliquot de 10 microlitres pour vérifier si la réaction est terminée par chromatographie sur couche mince. Si la réaction est complète, la molécule accepteur ne sera pas visible. Si la réaction n'est pas complète, l'accepteur sur la CCM reste visible.

Si tel est le cas, arrêtez le programme, réinitialisez le délai de glycosylation à environ 30 minutes, puis ajoutez un excès de promoteur triméthylsilo, trifluorométhanesulfonate. Lorsque la réaction est terminée, passez à l'étape suivante. Une fois la réaction achevée, le robot transfère le mélange réactionnel vers des cartouches SPE-FS contenant du gel de silice modifié par C nine F 17 pour la purification.

Ensuite, les cartouches sont lavées avec huit millilitres de méthanol à 80 %, suivis de huit millilitres de méthanol à 100 %. Afin d'éliminer la fraction non floris, l'écoulement est recueilli dans un flacon pour obtenir le produit marqué florist désiré. Si une purification supplémentaire est nécessaire, arrêtez le robot et retirez les produits de réaction appropriés.

En fonction de la structure, les donneurs peuvent être extrêmement peu réactifs et certaines molécules accepteurs de type « florist » peuvent rester présentes même après l'ajout d'un promoteur en quantité suffisante. Dans ce cas, la FSPE ne sera pas suffisamment efficace pour la purification, et une purification supplémentaire par chromatographie sur colonne de gel de silice peut être effectuée après que le bras robotisé ait dispensé du méthoxyde de sodium dans le tube à réaction. La réaction est ensuite agitée pendant deux heures sur la plateforme robotique ; si elle n'est pas terminée, comme déterminé par CCM, prolonger la période d'incubation d'environ une heure.

Après la fin de la réaction, le produit est purifié par SPE en phase fluide comme précédemment. Ensuite, retirez le produit de réaction du robot et, sur le plan de travail, soumettez-le à une dissolution dans du toluène anhydre, suivie d'une évaporation pour éliminer l'eau résiduelle. Une fois l'échantillon sec, replacez-le dans le robot et répétez le même cycle, incluant la purification par glycosylation par SPE en phase fluide.

La protection profonde du groupe protecteur temporaire suivie d'une glycosylation est répétée jusqu'à l'obtention de la longueur de chaîne souhaitée pour la molécule cible. Pour déprotéger le produit protégé obtenu à partir de l'automatisation, retirer le flacon du robot. Les étapes finales de la procédure utilisent du gaz hydrogène explosif et doivent être effectuées en dehors de la plateforme d'automatisation. Sur la paillasse, oz, la lyse de la double liaison dans la balise florist a lieu, suivie de l'oxydation de l'aldéhyde produit en acide carboxylique.

Purifiez le produit obtenu par chromatographie sur colonne de gel de silice en utilisant, sur un banc de laboratoire, un mélange de 30 % de méthanol dans le dichlorométhane. Enfin, pour déprotéger les groupes éther benzylique par hydrogénation catalysée au palladium, faites passer le produit à travers un tampon satellite afin d'éliminer le palladium et d'obtenir le produit final pur. Caractérisez complètement le produit par résonance magnétique nucléaire ou spectroscopie RMN.

La synthèse de polymères à haut rendement et la fabrication de nanoparticules sont réalisées selon le protocole décrit par Peterson et al. Comme indiqué dans le document accompagnant, l'appareil automatisé de dépôt utilisé pour la fonctionnalisation des particules se compose de trois pompes ne 1000, d'une plateforme robotisée intégrant deux actionneurs, l'un pour le déplacement dans la direction X et l'autre pour le déplacement dans la direction Y, ainsi que d'une seconde plateforme robotisée munie de deux racks adjacents comprenant trois actionneurs, un pour chaque direction, les pompes et un total de cinq actionneurs étant connectés. Les actionneurs et les pompes en série sont pilotés par un ordinateur à l'aide d'un logiciel LabVIEW.

Les systèmes de copolymères utilisés pour la fabrication des particules sont basés sur l'acide SEBA ou SA et un six bis, paraïc carboxy, oxil héxane ou CPH et un dix-huit bis para-carboxy phénoxy trois six dioxane ou CP Teeg. Après la fabrication des nanoparticules, placez un support contenant les tubes de centrifugation de 1,7 millilitre avec une bibliothèque de nanoparticules sur la plateforme de l'actionneur linéaire afin d'associer des glucides à la surface des particules de polyanhydride, et une réaction de couplage moyenne d'acide carboxylique, composée de deux réactions consécutives, est effectuée. Pour la première réaction, remplissez une seringue d'une pompe à seringue programmable avec une solution aqueuse d'EDC et d'éthylènediamine à une concentration de deux milligrammes par milligramme de nanoparticules et de 0,6 milligramme par milligramme de nanoparticules, respectivement.

Remplir une deuxième seringue d'une pompe à seringue programmable avec 2,5 milligrammes par milligramme de particules de NHSA, au total 12 équivalents par échantillon de nanoparticules, sous forme de solution aqueuse. Ensuite, à l'aide du programme LabVIEW, ordonner au robot de déposer des suspensions de réactifs dans la bibliothèque de nanoparticules. Les actionneurs du robot déplaceraient alors le porte-tube à la position correcte sur la plateforme pour la distribution des solutions, EDC et NHS.

Activer les groupes acides carboxyliques à la surface des nanoparticules de polyanhydride et permettre une couplage moyen. Ensuite, plonger une sonde de sonication dans chaque tube et soniquer chaque échantillon pendant 30 secondes à 40 hertz. Avant de passer à l'échantillon suivant, nettoyer la sonde avec de l'acétone.

Une fois que tous les échantillons sont saturés, le support à tubes est détaché de la plateforme robotique. Incubez les suspensions de nanoparticules pendant neuf heures avec une rotation constante à quatre degrés Celsius. Les temps de réaction pour la première et la deuxième réaction peuvent être modifiés afin d'ajuster la concentration finale en saccharide.

Une fois la réaction terminée, centrifuger les tubes à 12 000 ×g pendant cinq minutes. Dans un environnement froid, revenir à la station robotisée. Réattacher le support de tubes au bras robotique et remplir la deuxième seringue sur la plateforme robotique.

Avec de l'eau froide, la première seringue doit rester vide. Démarrez le robot. Le surnageant de chaque tube est aspiré dans la seringue vide et la deuxième pompe dépose de l'eau froide dans les tubes.

Cette étape est effectuée afin d'éliminer tous les réactifs inactifs des suspensions de nanoparticules. Ensuite, homogénéisez la suspension de nanoparticules par sonication, comme démontré précédemment. Puis, centrifugez les tubes à 12 000 ×g pendant cinq minutes.

Effectuez un deuxième lavage à l’eau froide en utilisant l’appareil robotisé pour la deuxième charge de réaction : introduisez 12 équivalents par échantillon de nanoparticules d’EDC dans la première pompe et 12 équivalents par échantillon de nanoparticules de NHS dans la deuxième pompe. Démarrez la plateforme robotisée afin de distribuer des volumes adéquats dans les tubes contenant les nanoparticules. La présence d’EDC et de NHS permettra la formation d’une liaison amide entre les groupes amine de l’éthylène dite déjà fixée à la surface des nanoparticules et le groupe acide carboxylique du sucre profondément protégé.

Une fois le dépôt terminé, introduire 10 équivalents d'un saccharide spécifique. Dans ce cas, le lactose a été utilisé ainsi que le contrôle acide glycolique dans les deux pompes disponibles. Chaque saccharide est déposé dans des tubes à essai selon la fonctionnalisation souhaitée à obtenir dans chaque tube, ce qui est préalablement programmé dans le logiciel LabVIEW, utilisé pour commander les actionneurs et les fonctions des pompes pour la réaction spécifique employée. Dans cette étude, l'acide glycolique est utilisé comme contrôle de liaison, car les saccharides fortement protégés possèdent déjà cette molécule liée de manière covalente, ce qui permet une fixation ultérieure à la surface des nanoparticules.

Les suspensions de nanoparticules sont homogénéisées par sonication comme précédemment, puis incubées pendant neuf heures avec une rotation constante à quatre degrés Celsius. Après incubation, laver les suspensions de nanoparticules par centrifugation, éliminer le surnageant, puis resuspendre le culot dans de l'eau froide et placer les tubes, qui contiennent désormais la bibliothèque de nanoparticules fonctionnalisées, dans une chambre sous vide pour les faire sécher pendant au moins deux heures. Les nanoparticules fonctionnalisées sont caractérisées par diffusion dynamique de la lumière et d'autres méthodes afin d'évaluer la composition de surface, la concentration, la taille des particules, la distribution de taille et la charge de surface.

Le côté diano entièrement protégé illustré ici a été synthétisé à l'aide de la plateforme d'automatisation. Le composé synthétisé a été caractérisé par résonance magnétique nucléaire du proton sur un spectromètre VXR de 400 mégahertz. En utilisant le CDC13 comme solvant, la formation du produit peut être confirmée par la présence de certains pics caractéristiques.

Dans le diagramme de RMN du proton, les quatre protons situés entre 1,79 et 2,21 et les deux protons à 3,38 proviennent de la balise florale. Le pic singulet à 2,16 correspond au pic d'acétate ; les pics à 4,94 et 5,11 sont les protons anomériques permettant d'évaluer l'effet de la durée de réaction sur la morphologie finale des nanoparticules et sur le degré d'attachement du sucre obtenu. Les nanoparticules ont été fonctionnalisées avec des durées de réaction croissantes : comme indiqué ici, la concentration de diano à la surface des nanoparticules 50 50 CPT CPH a augmenté avec la durée totale de la réaction et a atteint un maximum après 18 heures.

Des nanoparticules fonctionnalisées avec un temps de réaction total de 24 heures ont ensuite été utilisées pour évaluer leur capacité à cibler les récepteurs de type lectine C (CLRs) sur des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse de souris, en utilisant la cytométrie en flux comme illustré ici. Une expression accrue du récepteur DC sign et du récepteur mano vers les récepteurs de type lectine C a été observée après stimulation par des nanoparticules non fonctionnalisées ainsi que par des nanoparticules fonctionnalisées au lactose et au dano. Cela indique un ciblage efficace.

Cependant, les particules fonctionnalisées par Diano ont montré un niveau d'expression plus élevé, indiquant une spécificité de cet ligand pour les récepteurs étudiés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser la synthèse automatisée à haut débit d'oligosaccharides ainsi que la fonctionnalisation de nanoparticules poly. En utilisant ces agents ciblants à base de glucides, une fois maîtrisée la synthèse du sucre protégé donneur-accepteur, ainsi que l'assemblage de l'appareillage, l'ensemble peut être effectué en 24 à 48 heures.

Bien sûr, la durée dépend de la taille de la bibliothèque ainsi que du temps de fonctionnalisation. Lors de l'application de cette méthode, il est important de garder à l'esprit que vous pouvez optimiser les conditions réactionnelles de la fonctionnalisation de particules polyhydro biodégradables en fonction de la chimie des nanoparticules. En suivant cette procédure, diverses structures de glucides peuvent être synthétisées afin de cibler différents récepteurs cellulaires et ainsi influencer la réponse immunologique.