Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Ce vidéodécrit la synthèse combinatoire de bibliothèques de films et de nanoparticules en polyanhydride biodégradable, ainsi que la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques. Premièrement, un dispositif automatisé de dépôt à haut débit est utilisé pour déposer un ensemble de monomères aux compositions variées dans des cuvettes en verre. Une réaction de polycondensation est réalisée à 180 degrés Celsius et 0,3 torr pendant 1,5 heure.

Ces conditions de réaction sont spécifiques à la synthèse du polymère d'anhydride poly C-P-H-S-A. À l'aide de l'appareil de dépôt automatisé, le solvant et tous les composants destinés à l'encapsulation sont déposés dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères. Une sonication peut être effectuée pour garantir la dissolution complète du polymère et une dispersion uniforme des composants supplémentaires.

Ensuite, le polymère dissous est transféré dans un tube contenant un solvant non miscible afin de fabriquer la bibliothèque de nanoparticules par nanoprécipitation. Les nanoparticules sont récupérées par séchage sous vide ou par filtration, puis transférées dans une plaque modifiée de 96 puits libérée. Enfin, la bibliothèque chargée en protéine est incubée dans des conditions physiologiques et la cinétique de libération de la protéine est évaluée à l’aide d’une méthode de détection fluorescente par espace.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant la cinétique de libération des protéines en fonction des propriétés du polymère ou des conditions du milieu de libération. Le principal avantage de cette approche par rapport aux autres techniques conventionnelles analysant un échantillon à la fois réside dans la capacité à synthétiser simultanément plusieurs échantillons. Ces échantillons peuvent ensuite être criblés à haut débit afin d'étudier les interactions entre protéines, polymères, cellules et polymères hôtes.

Cela accélère alors la conception et le développement rationnels de ces biomatériaux pour la délivrance de médicaments et le génie tissulaire. La Tricia Peterson, une post-doctorante de mon laboratoire, démontrera la procédure. Dans cette section de la vidéo, un appareil de dépôt à haut débit Hyatt est utilisé pour déposer une bibliothèque de monomères à composition variable après la synthèse du polymère.

Cet appareil est utilisé pour fabriquer une bibliothèque combinatoire de films polymères ou de nanoparticules vides ou chargés de protéines. La plateforme automatisée comprend deux pompes à seringue programmables et trois actionneurs linéaires connectés en série à un ordinateur. Un logiciel LabVIEW est utilisé pour envoyer des commandes aux pompes à seringue et aux actionneurs.

Des seringues gast tight de 10 cc sont chargées dans les pompes à seringue avec des tubes capillaires en métal reliés par des raccords filetés, qui dispensent les solutions polymériques dans des cuvettes en verre. Dans cette démonstration, de l'acide seic ou SA sera utilisé avec un six Biss para oxy heane ou CPH pour créer une bibliothèque de nanoparticules encapsulant l'albumine sérique de bovin marquée Texas Red. Les instructions fournies dans cette vidéo et les documents accompagnants peuvent être adaptées pour fabriquer et tester une grande variété de bibliothèques de films polymériques et de nanoparticules.

Pour synthétiser les bibliothèques, commencez par dissoudre chaque monomère et le chloroforme à une concentration finale de 25 milligrammes par millilitre dans un flacon en verre. Ensuite, chargez chaque solution dans une seringue étanche de 10 cc en aspirant la solution par l'extrémité munie du système de verrouillage de l'aiguille. Éliminez toutes les bulles d'air.

Ensuite, fixez le tube capillaire en acier inoxydable muni d'un bouchon verrou résistant au solvant à l'extrémité de la seringue. Maintenez les tubes capillaires en place à l'aide de pinces fixées sur un support en anneau. Puis placez l'extrémité des deux tubes capillaires dans le réservoir de départ.

Pour le dépôt du monomère. Placer les seringues sur les pompes à seringue programmables et les verrouiller en position dans le logiciel de visualisation en laboratoire. Régler les actionneurs linéaires sur la position initiale dans le logiciel.

Commencer le dépôt automatisé des monomères SA et CPH dans les cuvettes en verre selon les axes x, y et Z. Des actionneurs positionneront correctement les tubes capillaires dans chaque cuvette et pomperont des volumes programmés de chaque monomère, créant ainsi une bibliothèque de monomères présentant une variabilité compositionnelle. Après le dépôt des monomères.

Transférez la bibliothèque de monomères dans une étuve à vide préchauffée et incubez à 180 degrés Celsius et 0,3 torr pendant 1,5 heure afin de permettre la polymérisation par condensation. Après l'incubation, la fabrication de la bibliothèque de polymères est terminée. Ensuite, des nanoparticules polymériques chargées en protéines sont générées.

Voir le protocole accompagnant la fabrication d'une bibliothèque de films polymères chargés en protéine pour la préparation d'une bibliothèque de nanoparticules chargées en protéine. Ajouter la protéine, dans ce cas l'albumine sérique bovine marquée par le rouge Texas, au solvant approprié, qui doit être capable de dissoudre la bibliothèque de polymères. Ici, le chlorure de méthylène est utilisé à une concentration de deux milligrammes par millilitre.

Remplissez la seringue de 10 cm³ avec le solvant contenant l'albumine de sérum bovin marquée par le Texas Red et placez-la dans la première pompe à seringue. Ensuite, placez une seringue propre et vide de 2 cm³ dans la seconde pompe à seringue, puis positionnez les tubes contenant 15 millilitres d’un non-solvant, dans ce cas du pentane, dans le support de tubes adjacent à la plateforme des vials. Ensuite, dans le logiciel LabView, démarrez le processus automatisé de dépôt du solvant en sélectionnant le programme.

Après le démarrage du programme, le solvant est déposé dans les cuvettes contenant la bibliothèque de polymères, ce qui donne une concentration de polymère de 20 milligrammes par millilitre. Une fois que tout le solvant a été déposé, laissez-le dissoudre le polymère pendant une à cinq minutes. Procédez ensuite à une homogénéisation facultative afin d'assurer une dissolution complète du polymère et une dispersion uniforme des protéines.

Ensuite, lancez le programme de transfert des échantillons dans LabVIEW. Chaque échantillon de polymère dissous dans la bibliothèque est alors aspiré dans la seringue vide et distribué dans le tube correspondant contenant le solvant non solvant du porte-échantillons. Une fois que chaque échantillon a été transféré, récupérez les nanoparticules chargées en protéine en plaçant la bibliothèque de nanoparticules dans une chambre sous vide à 10 millimètres de mercure, ou en utilisant une filtration sous vide jusqu'à élimination du solvant.

Pour étudier la libération de l'albumine sérique bovine (BSA) encapsulée, commencez par une plaque polypropylène profonde de 96 puits, modifiée en retirant la moitié supérieure du bord de chaque puits dans chaque colonne adjacente de la plaque. Le retrait de la partie supérieure de chaque puits entre les colonnes A et B, C et D, E et F, ainsi que G et H permet un écoulement de liquide entre chaque paire de puits adjacents lorsqu'ils sont remplis à pleine capacité. Ajoutez des étalons de BSA marquée au Texas Red, allant de 1000 à 10 microgrammes par millilitre, dans la plaque profonde de 96 puits.

Ces éléments seront utilisés pour calculer la quantité de protéines et tiendront également compte de l'extinction du fluorochrome. Reconstituez la masse souhaitée de nanoparticules dans du tampon PBS, puis soumettez-les à une sonication afin de disperser uniformément les particules. Ensuite, transférez la bibliothèque de nanoparticules dans la plaque de 96 puits profonde et attendez que les échantillons se déposent au fond de la plaque. Puis, à l’aide d’une pipette, remplissez lentement tous les puits adjacents avec du tampon PBS jusqu’à un quart de pouce du bord supérieur du puits.

Il doit y avoir suffisamment de tampon dans les puits adjacents pour permettre une circulation libre entre les puits. Ensuite, sceller la plaque de libération avec le couvercle et la placer à 37 degrés Celsius sous agitation. Pendant toute la durée de l'expérience, à des intervalles de temps réguliers, utiliser un scanner fluorescent plat Typhoon 9 400 pour numériser la plaque en utilisant les filtres d'excitation, de laser et d'émission appropriés.

Après la numérisation, utilisez un logiciel de quantification d'images pour mesurer la quantité de protéine marquée au fluorochrome libérée dans chaque prélèvement. Dans cette étude, la BSA marquée au Texas Red a été encapsulée dans une bibliothèque de nanoparticules polymériques synthétisées à partir de monomères d'acide stéarique (SA) et de CPH, comme décrit dans cette vidéo, afin de déterminer la cinétique de libération des protéines en fonction de la chimie du polymère. Les nanoparticules chargées en protéine ont été incubées à 37 degrés Celsius pendant un mois, durant lequel des analyses fluorescentes ont été effectuées à des intervalles de temps réguliers afin de quantifier la libération de la protéine.

Comme illustré ici, cette méthode à haut débit a été utilisée pour déterminer la cinétique de libération de la BSA marquée au Texas Red à partir d'une bibliothèque de nanoparticules en polyanhydride A-C-P-H-S-A. Des tendances dépendant de la chimie ont été observées, avec des taux de libération croissants pour les chimies de films de Sarin. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des dosages standards de quantification des protéines.

Dans une expérience distincte, la libération de BSA Texas Red à partir de bibliothèques de films de polyanhydride CPH CPT a été évaluée ; comme indiqué ici, des cinétiques de libération proches d'un ordre zéro ont été observées, les films riches en cpeg libérant la protéine le plus rapidement, avec des applications potentielles dans le domaine médical en tant que dispositifs biodégradables de délivrance de médicaments. Ces résultats indiquent que le profil de libération souhaité d'un médicament thérapeutique ou d'un antigène vaccinal peut être contrôlé en modifiant la chimie du polymère. Suite à cette procédure, d'autres méthodes combinatoires ont été développées pour étudier des domaines tels que la stabilité des protéines, la toxicité cellulaire, l'activation cellulaire et la biodistribution InVivo.

Ces aspects sont importants pour la conception rationnelle de biomatériaux destinés à la délivrance de médicaments et au génie tissulaire. N'oubliez pas de porter des équipements de protection individuelle adéquats et de respecter les procédures de laboratoire sécuritaires tout au long de ce protocole complet.