High Throughput unicellulaire et multiples cellules de micro-encapsulation

Les applications utilisant des cellules encapsulées dans de petites gouttes de volume picolitrique ont souvent été limitées par l'impossibilité de contrôler le nombre de cellules par goutte. Ce protocole décrit une méthode permettant de contrôler l'encapsulation cellulaire en combinant deux phénomènes microfluidiques distincts : l'ordonnancement hydrodynamique des cellules et la génération de gouttes au niveau d'une microbuse à focalisation d'écoulement. Dans un canal amont, un débit suffisamment élevé d'une solution aqueuse contenant des cellules ou des particules en suspension est appliqué, provoquant la formation de trains de cellules espacées uniformément dans la direction de l'écoulement en aval.

Une buse de génération de gouttelettes par focalisation de flux est utilisée pour former des gouttelettes aqueuses à des taux de l'ordre du kilohertz dans un fluide porteur d'huile admissible stabilisé par un tensioactif. Les trains ordonnés de cellules ou de particules sont ensuite combinés à la génération de gouttelettes en ajustant les débits des phases aqueuse et huileuse de manière à synchroniser la formation des gouttelettes avec l'arrivée, au niveau de la buse, de cellules ou de particules disposées longitudinalement, les particules servant ici de substituts aux cellules. Pour illustrer ce protocole, les débits doivent être suffisamment faibles afin de limiter les effets du fluide.

Les contraintes de cisaillement sur les cellules biologiques, le chevauchement du classement des cellules, la génération de gouttes et la viabilité cellulaire. Les limitations du débit aqueux offrent un régime opérationnel idéal pour l'encapsulation contrôlée de cellules uniques ou multiples. L'analyse de données de microscopie vidéo montre que les rendements d'encapsulation, tant pour une cellule seule que pour deux cellules ou particules, surpassent les rendements d'encapsulation aléatoires et réduisent considérablement le nombre de gouttes ne contenant pas le nombre souhaité de cellules ou de particules.

Le confinement des cellules et des gouttes limite la dilution des sécrétions cellulaires, met en évidence l'hétérogénéité cellulaire et permet également de contrôler les signaux intercellulaires par rapport à une suspension en masse. Des méthodes efficaces pour encapsuler ces cellules dans des gouttes constituent un outil précieux pour les chercheurs en biologie. Pour commencer cette procédure, concevez un motif de microcanal tel qu'illustré sur cette figure à l'aide du logiciel AutoCAD.

La section du canal long représente le canal d'écoulement aqueux d'ordonnancement avec une largeur de 27 microns. Le schéma agrandi de la buse montre des largeurs de canal égales de 27 microns pour le canal aqueux d'ordonnancement et le canal d'huile, suivies du rétrécissement de la buse à 22 microns et d'une expansion soudaine vers un canal plus large de 61 microns. La hauteur du dispositif est de 52 microns.

Les deux entrées, aqueuse et huileuse, sont équipées de filtres anti-salissures de grande taille dont les interstices ont une dimension comparable à celle de la largeur du canal d'ordonnancement, comme illustré par ce schéma agrandi de l'entrée d'huile. Voici une image réelle du canal d'ordonnancement et de la buse, injectés avec un colorant. Faire appel à un fabricant tiers pour imprimer un masque de transparence haute résolution sur film Mylar ou sur quartz, où les canaux sont transparents sur fond sombre.

Créez ensuite un moule maître en silicium et en photo-résine SU-8 pour le moulage par réplication. Fixez le moule maître au fond d'une boîte de Pétri pour le moulage par réplication de PDMS. Une fois le moulage par réplication terminé et le contour du dispositif découpé, utilisez un poinçon de biopsie de 0,75 mm de diamètre extérieur pour percer les orifices fluidiques dans les trois régions circulaires indiquées sur cette figure. Appliquez du ruban adhésif Scotch sur le côté du motif du PDMS, puis décollez-le pour éliminer toute poussière après la liaison par plasma.

Le PDMS sur une lame de microscope en verre propre. Placer l'appareil entier dans un four et chauffer progressivement le four jusqu'à 120 degrés Celsius. Laisser l'appareil dans le four à 120 degrés Celsius toute la nuit pour terminer l'assemblage et ramener le PDMS à son état hydrophobe d'origine.

Une méthode alternative pour rendre hydrophobe la surface en verre du canal consiste à injecter un revêtement tel que l'aquae dans les ports fluidiques, puis à purger avec de l'air. À l'aide d'une seringue d'un millilitre et d'une aiguille, aspirer plusieurs centaines de microlitres d'air, suivis d'une très petite quantité d'aquil, suffisante pour remplir uniquement l'embout métallique de la seringue. Injecter ensuite soigneusement, mais fermement, l'aqua, suivie de l'air de purge, dans les ports fluidiques, sans rompre l'adhérence entre le PDMS et le verre.

Répétez la purge d'air sur tous les ports d'entrée et de sortie tout en essuyant tout excès d'eau afin d'éviter les dépôts pouvant obstruer les canaux lors du séchage. La maîtrise de la concentration cellulaire est essentielle pour obtenir le nombre approprié de cellules par rapport au nombre approprié de gouttes. Cela comporte deux aspects difficiles.

La première consiste à estimer correctement la concentration au préalable, et la seconde à maintenir cette concentration durant l'expérience. Pour le dispositif particulier utilisé dans cette étude, des cellules ou particules de huit à 15 microns devraient s'ordonner adéquatement pour une encapsulation contrôlée. Dans cette démonstration, des microsphères polys diaryle de 9,9 microns seront utilisées comme substituts cellulaires afin de préparer la concentration de la suspension aqueuse de particules pour obtenir une encapsulation optimale. Commencez avec une concentration stock de microsphères de 1 % en solides en poids, en vous appuyant sur des données antérieures pour un ordonnancement complet. À titre indicatif, augmentez la concentration à 1,5 % en solides en centrifugeant doucement un millilitre de l'échantillon stock, en éliminant 250 microlitres du liquide surnageant et en resuspendant les particules par agitation vortex ou un mélange plus doux.

Lorsqu'on utilise des cellules, les cellules et les particules de polystyrène ont toutes deux une densité supérieure à un, bien que cela ne soit pas illustré dans cette vidéo. Pour des expériences à long terme, durant plusieurs minutes à plusieurs heures, la solution peut être ajustée en flottabilité en ajoutant un soluté tel que le chlorure de calcium pour les particules ou de l'OptiPrep pour les cellules. Une fois la suspension de cellules ou de particules prête, préparez un échantillon de 10 millilitres de la phase continue d'huile fluorée dans un tube à centrifuger de 15 millilitres à l'aide d'un vortex.

Mélangez le tensioactif et l'huile de fluorocarbone à environ 2,5 % en poids. Ici, nous obtenons un mélange de 2,4 % en poids, ce qui est acceptable pour mettre en place l'expérience de micro-encapsulation. Commencez par allumer l'alimentation du microscope optique inversé et de la caméra haute vitesse.

Concentrez-vous sur la couche du microcanal et inspectez les canaux à la recherche d'obstructions et de tout débris susceptible de se détacher. Sélectionnez un canal exempt de gros débris ou d'obstructions évidentes. Coupez trois morceaux de tube en PVC translucide Tigon pour l'entrée de la phase aqueuse, l'entrée de l'huile et la sortie de l'émulsion afin de minimiser le volume mort.

Coupez un morceau de tube suffisamment long pour aller des pompes à seringue jusqu'au microscope. Taillez les extrémités des tubes à un angle de 45 degrés afin de faciliter leur insertion dans les ports fluidiques. Utilisez des pinces pour insérer fermement les extrémités des tubes dans les ports fluidiques. Ensuite, insérez fermement une aiguille de seringue en acier inoxydable sans biseau de calibre 30 dans l'extrémité libre du tube d'entrée aqueuse.

Répétez pour le tube d'entrée d'huile. Déplacez l'appareil et fixez le tube sur la platine du microscope à l'aide d'un objectif de 20 fois ; alignez et focalisez sur la buse de l'appareil. Ajustez manuellement le microscope pour obtenir une illumination de Köhler afin d'assurer un éclairage optimal dans le plan focal.

À l’aide du logiciel de la caméra haute vitesse, recadrez le champ autour de la buse afin d’obtenir des fréquences d’images plus élevées, puis réglez la fréquence d’images, le temps d’exposition et les autres paramètres de la caméra selon les besoins pour un enregistrement optimal. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution aqueuse bien mélangée préparée au préalable. Remplissez une seringue de trois millilitres avec la solution de phase huileuse.

Inclinez l'un des seringues remplis verticalement et donnez une petite tape pour faire remonter les bulles d'air vers l'extrémité de la seringue. Appuyez lentement sur le piston suffisamment longtemps pour chasser l'air vers l'embout de la seringue, en maintenant celle-ci en position verticale. Connectez la seringue à l'aiguille correspondante déjà fixée au dispositif.

Appuyez sur le piston pour forcer l'air à traverser le volume mort de l'aiguille de la seringue jusqu'à ce que le liquide soit expulsé à travers le tube et arrive presque au dispositif. Fixez fermement la seringue sur une pompe à seringue et engagez le poussoir du piston. Répétez les branchements pour la deuxième seringue et montez-la sur une deuxième pompe à seringue. Mettez chaque pompe à seringue sous tension et programmez-les. Selon les protocoles du fabricant, réglez les débits initiaux à 50 microlitres par minute pour la phase huileuse et à cinq microlitres par minute.

Pour le démarrage en phase aqueuse, les pompes attendent que chaque fluide pénètre dans le dispositif et remplisse les canaux en chassant l'air résiduel. Cela peut prendre plusieurs minutes avec les débits initiaux. Observer la formation des gouttes à l'embout.

Augmentez lentement le débit du flux aqueux afin d'observer l'alignement des particules dans le long canal de solution aqueuse. À mesure que le débit augmente, ne l'augmentez pas au point de provoquer un jet du flux de fluide aqueux au niveau de la buse, comme illustré dans cet exemple, utilisant une buse de génération de gouttes différente. Notez ici l'écoulement instable et la formation incohérente de gouttes. Si la concentration en particules est trop faible pour produire des trains alternés avec relativement peu de particules manquantes et que l'échantillon n'a pas été ajusté en flottabilité, inclinez physiquement la pompe à perfusion vers la sortie de la seringue afin de permettre un dépôt graduel des particules vers les sorties des seringues.

Une fois qu'un ordonnancement adéquat est obtenu, ajustez le débit d'huile pour régler la fréquence de génération et la taille des gouttes. Ajustez de manière itérative les deux débits afin d'obtenir les taux d'encapsulation et les volumes de gouttes souhaités. Une fois qu'une encapsulation ordonnée stable est confirmée, déplacez le tube de sortie du réservoir de déchets vers un réservoir de collecte en vue d'une utilisation ultérieure.

Une encapsulation simple ou double de particules ou de cellules peut être réalisée avec une grande efficacité. L'utilisation de ce protocole, illustré ici, donne un résultat représentatif d'une encapsulation individuelle de particules avec un débit d'huile de 60 microlitres par minute et un débit aqueux de neuf microlitres par minute. Lambda, le nombre moyen de particules par goutte, est de 0,95.

L'espacement des particules dans la direction de l'écoulement est d'environ 17 à 18 micromètres pour des particules alternées parfaitement ordonnées. La fréquence de génération des gouttelettes dans cet exemple est de 6,1 kilohertz avec une taille moyenne de gouttelette de 24,4 picolitres. L'histogramme compare l'efficacité de l'encapsulation des particules par goutte, en ordre, pour l'encapsulation d'une seule particule avec plus.

En statistique, concernant l'encapsulation aléatoire pour une taille d'échantillon de 517 gouttes, la fraction moyenne de gouttes contenant une particule est de 79,5 %, contre une fraction d'encapsulation aléatoire prédite de 36,7 %. La fraction de particules qui se retrouvent dans les gouttes correctement encapsulées a été observée à 83,7 % pour une taille d'échantillon de 491 particules, tandis que la fraction d'encapsulation aléatoire était de 37,3 %. L'encapsulation de deux particules est obtenue simplement en réduisant le débit d'huile à 30 microlitres par minute, tout en maintenant le débit aqueux à neuf microlitres par minute. Ici, lambda, le nombre moyen de particules par goutte, est de 1,8, de façon similaire à l'encapsulation d'une seule particule.

L'espacement des particules dans la direction de l'écoulement est d'environ 17 à 18 micromètres pour les particules alternées parfaitement ordonnées. Les gouttes plus grandes ont une taille moyenne de 39,8 picolitres et se sont formées à une fréquence de 3,8 kilohertz par rapport à l'encapsulation aléatoire. Pour un échantillon de 383 gouttes, la fraction moyenne de gouttes d'encapsulation ordonnée contenant deux particules est de 71,5 %, contre une fraction d'encapsulation aléatoire prédite de 26,8 %. La fraction de particules se retrouvant dans les gouttes correctement encapsulées a été observée à 79,5 % pour un échantillon de 689 particules, tandis que la fraction d'encapsulation aléatoire était de 33,4 %.

Ensemble, ces résultats montrent que les rendements d'encapsulation, tant pour une particule unique que pour deux particules, surpassent de plus d'un facteur deux les rendements d'encapsulation aléatoire et réduisent considérablement le nombre de gouttes ne contenant pas le nombre souhaité de cellules ou de particules. L'importance d'une concentration adéquate des particules ou des cellules pour un rendement d'encapsulation élevé est illustrée lors de cet essai expérimental. Bien que les débits de la phase huileuse et de la phase aqueuse soient identiques à ceux utilisés lors de l'essai d'encapsulation double décrit précédemment, le nombre moyen de cellules par goutte, lambda, est réduit à 1,57.

Par conséquent, l'ordonnancement complet ne se produit pas, et des trous apparaissent ainsi dans les trains, laissant des gouttes avec moins de particules que prévu. Cet histogramme montre l'efficacité réduite de l'encapsulation de deux particules en raison de la valeur plus faible de Lambda. Pour une taille d'échantillon de 324 gouttes, la fraction moyenne de gouttes contenant deux particules était de 55,9 %, avec presque autant de gouttes contenant une seule particule que de gouttes contenant deux particules.

Cela indique que Lambda devrait être égal ou proche du nombre de cellules souhaitées par goutte afin de maximiser le nombre de particules ou de cellules correctement encapsulées, la valeur exacte de lambda étant choisie en fonction de la tolérance à un nombre inférieur ou supérieur de cellules par goutte. Dans cette démonstration, nous exploitons les différences de flottabilité pour permettre un contrôle en temps réel de la concentration au cours de l'expérience. Toutefois, pour des expériences de plus longue durée, il pourrait être conseillé d'ajuster la flottabilité afin d'obtenir des résultats plus constants après l'encapsulation des cellules dans des gouttes aqueuses.

Des expériences dépendantes du temps peuvent être réalisées dans un tube à centrifuger ou au microscope en réinjectant les gouttelettes dans des réseaux microfluidiques.