Microdialyse d'éthanol au cours de l'éthanol détermination opérant auto-administration et d'éthanol par chromatographie en phase gazeuse

L'objectif général de cette procédure est de surveiller les concentrations d'éthanol dans le dialysat cérébral au cours d'une séance d'auto-administration d'éthanol. Afin de comparer cette mesure aux comportements d'auto-administration synchrones, on commence par implanter chirurgicalement une canule-guide de microdialyse, une canule et un dispositif d'ancrage, puis on entraîne des rats à s'auto-administrer de l'éthanol de manière opérante. La deuxième étape consiste à habituer les rats au dispositif d'ancrage crânien afin qu'il ne gêne pas l'auto-administration d'éthanol pendant la microdialyse.

Ensuite, une microdialyse est réalisée pendant une séance d'auto-administration d'éthanol, au cours de laquelle une partie du dialysat est préparée pour l'analyse de l'éthanol. Puis, les échantillons de dialysat sont analysés pour déterminer la concentration d'éthanol à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme. Enfin, les résultats obtenus montrent l'évolution temporelle de la concentration d'éthanol dans la région cérébrale d'intérêt au cours d'une séance d'auto-administration d'éthanol.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la ponction de la veine caudale ou saphène, est que cette procédure est minimalement invasive au moment du prélèvement et permet la mesure du médicament dans le temps au niveau de la région cérébrale d'intérêt pendant que l'animal effectue une tâche comportementale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elle requiert plusieurs compétences spécialisées, dont beaucoup ne peuvent être acquises qu'au travers d'une pratique ou d'une expérience répétée. La démonstration de la procédure sera assurée par Jeffrey Dilley, un assistant de recherche étudiant de notre laboratoire.

Toutes les procédures animales décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation de l'Université du Texas et suivent toutes les directives réglementaires relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire. L'Université du Texas à Austin est un établissement accrédité par l'ALAC utilisant des rats Long Evans bien habitués, munis chirurgicalement d'une canule de 21 gauge placée au-dessus de la région cérébrale d'intérêt, pour ces expériences comportementales de microdialyse. Tous les animaux doivent bénéficier d'au moins une semaine de soins postopératoires et de récupération, et être en bonne santé avant de commencer les procédures suivantes.

Placer le rat dans une chambre opérante Med Associates équipée d'un levier rétractable Lichter et d'un tube distributeur, et l'entraîner à appuyer sur le levier pour accéder à une solution de saccharose à 10 %. Une fois que le rat est entraîné à répondre pour obtenir la solution de saccharose, commencer un programme d'entraînement approprié au cours duquel de l'éthanol est progressivement ajouté à la solution au cours de plusieurs séances de consommation la nuit précédant l'avant-dernière séance opérante. Après avoir anesthésié l'animal et vérifié le niveau de sédation, fixer le ressort de la liaison au boulon de fixation situé sur le support crânien du rat afin de l'habituer à l'appareil, composé d'un levier équilibreur, d'un bras, d'une liaison rotative, d'un ressort et d'un support à anneaux.

Laisser le rat passer la nuit dans la chambre opératoire, dans sa cage d'origine, avec accès libre à la nourriture et à l'eau, puis réaliser la séance d'entraînement du lendemain avec le câble de raccordement et le matériel associé mis en place la veille de l'expérience de microdialyse. Après avoir anesthésié le rat à l'isoflurane, vérifier l'état de sédation en effectuant une pression sur l'orteil, puis insérer une sonde de microdialyse perfusée avec un liquide céphalo-rachidien artificiel. Fixer correctement la sonde, puis régler le débit de la sonde à 0,2 µL par minute.

Placer le rat dans sa cage d'origine dans la salle conditionnelle pour y passer la nuit, tout l'équipement de dialyse en place, et fournir de la nourriture et de l'eau ad libitum. Le jour suivant l'insertion de la sonde, au moins deux heures avant le début de l'expérience, augmenter le débit de la sonde jusqu'à atteindre son débit de fonctionnement. À l’aide d’une seringue Hamilton, vérifier que le débit de la sonde est constant et représente au moins 90 % du débit prédéfini.

Si l'on évalue les neurotransmetteurs dans les échantillons de dialyse, prélevez des échantillons durant toutes les phases de l'expérience. Commencez par recueillir des échantillons de dialyse pendant que l'animal se trouve dans sa cage d'origine. Conservez les échantillons de manière appropriée en vue d'une analyse ultérieure.

Transférez soigneusement le rat dans la chambre opérante et démarrez le programme opérant qui contrôle la chambre. Continuez à prélever des échantillons pendant que le rat attend que le levier s'étende dans la chambre, deux échantillons avant que le levier ne s'étende. Commencez à recueillir une portion de chaque échantillon de dialysat pour l'analyse de l'éthanol en pipettant un aliquot approprié de dialysat dans un flacon en verre de deux millilitres et en scellant le flacon avec une septum étanche, pipetez et scellez rapidement les échantillons d'éthanol.

Étant donné que l'éthanol est volatil et que le volume d'échantillon est faible, une préparation incohérente ou lente des échantillons entraînera des résultats inexacts. Conserver le reliquat pour l'analyse des neurotransmetteurs. La période de consommation de 20 minutes commence après que le programme informatique de Med Associates ait sorti le levier dans la chambre et que le rat appuie dessus pour accéder à une bouteille de solution buvable.

Continuer à prélever des échantillons tout au long de la période de consommation de boisson. Une fois la période de boisson terminée, le programme informatique retire la bouteille de la chambre. Maintenir l’animal dans la chambre pendant une période postérieure supplémentaire de 20 minutes à la fin de l’expérience de microdialyse. Après avoir anesthésié le rat, retirer la sonde.

Si l’animal n’est pas euthanasié de manière humanitaire immédiatement, remplacez l’obturateur afin d’assurer la visualisation du trajet de la sonde. Prélevez le cerveau dans les trois jours suivant l’expérience. Analysez les échantillons conjointement avec des étalons externes d’éthanol à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse muni d’un détecteur à ionisation de flamme, d’un échantillonneur automatique en espace de tête chauffé à 50 degrés Celsius, et d’une colonne capillaire utilisant l’hélium comme phase mobile.

Pour enregistrer et analyser les chromatogrammes, utilisez un logiciel de station de travail en chromatographie afin de préparer le système pour l'analyse de l'éthanol. Utilisez un bain-marie à circulation d'eau pour chauffer la plaque de l'échantillonneur automatique et ouvrez les bouteilles d'air et d'hydrogène. Ensuite, lancez le programme de démarrage.

Lorsqu'elle est prête, initier une combustion de 20 minutes, qui décontamine la fibre. Préparer des étalons à l'aide d'une fiole jaugée de 100 millilitres en diluant 238 microlitres d'éthanol à 95 % avec de l'eau jusqu'à un volume final de 100 millilitres. Utiliser une dilution sérielle un-à-un pour créer les étalons.

Prélèvez les étalons à l’aide d’une pipette et placez-les dans des vials en verre que vous scellerez exactement comme les échantillons préparés. Veillez à inclure un blanc d’eau parmi vos étalons. Placez les étalons et les échantillons dans le plateau de l’auto-échantillonneur, puis chauffez-les jusqu’à ce que toute la prise aliquote liquide soit complètement vaporisée.

Pour exécuter les échantillons et les standards, créez une liste d'échantillons indiquant quel échantillon se trouve dans chaque emplacement du carrousel automatique, et précisez que chaque échantillon doit être perforé. Une fois les fichiers de données dirigés vers un dossier sélectionné, choisissez une méthode appropriée pour les échantillons et lancez l'analyse. Après que le système ait traité tous les échantillons, vérifiez que le programme a correctement intégré chaque pic.

Tracez la hauteur des pics en fonction de chaque étalon externe connu. Concentration en éthanol. Utilisez la fonction linéaire fournie par les points pour interpoler la concentration en éthanol de chaque échantillon de dialysat.

Cette figure présente des exemples de chromatogrammes pour trois concentrations d'étalons d'éthanol et un échantillon de dialysat de rat recueilli à la fin de la séance d'auto-administration d'éthanol. Les pics d'éthanol doivent être relativement symétriques, présenter des temps de rétention constants et un rapport signal sur bruit supérieur à 10. L'incapacité à satisfaire à ces critères indique que le système nécessite un entretien, une chromatographie de qualité, et que les étalons correctement préparés produisent une courbe d'étalonnage linéaire utilisée pour calculer la concentration d'éthanol dans les échantillons de dialysat prélevés chez les animaux s'auto-administrant de l'éthanol au cours de leur séance d'auto-administration.

Les concentrations d'éthanol dérivées dans le dialysat ne sont pas corrigées en fonction du rendement du capteur in vivo et ne représentent qu'une fraction de la concentration tissulaire cérébrale en éthanol. Si une microdialyse quantitative de l'éthanol est requise, la fraction d'extraction de l'éthanol qui diffuse depuis l'espace extracellulaire vers le capteur est déterminée expérimentalement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures environ, si elle est effectuée correctement.

Cela variera en fonction de la durée de la session comportementale. La réussite de la phase de microdialyse de l'expérience dépend grandement de la qualité des phases préparatoires. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de s'assurer que vos rats sont bien manipulés et qu'ils ont été habitués à tout stimulus potentiellement perturbateur pouvant survenir pendant l'expérience de dialyse, afin que le comportement d'automédication de l'animal ne soit pas affecté.