L'identification des composés volatils olfactifs chromatographie en phase gazeuse-à logements multiples enregistrements (GCMR) dans le lobe antennaire des insectes

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les odorants biologiquement actifs dans un mélange complexe à l'aide d'enregistrements effectués dans le cerveau du bourdon. Cette identification s'effectue en trois étapes : premièrement, la collecte des odeurs présentant un effet comportemental ; deuxièmement, la préparation du chromatographe en phase gazeuse et des systèmes d'enregistrement multicanal pour l'expérience ; et troisièmement, la préparation et la dissection du cerveau du bourdon afin d'effectuer les enregistrements neuronaux dans le lobe antennaire.

L'expérience est ensuite menée en insérant les électrodes dans un lobe antennaire et en mesurant les réponses aux composés volatils pulvérisés par analyse de l'activité neuronale induite par des mélanges odorants complexes et par leurs constituants individuels. Les odorants biologiquement actifs peuvent être identifiés par chromatographie en phase gazeuse. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes comme la G-C-E-A-G réside dans la sensibilité des neurones des antennes et dans la capacité à caractériser la manière dont les neurones cérébraux répondent à des volatils floraux spécifiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la combinaison d'étapes électrophysiologiques et d'analyses chimiques est difficile à apprendre en raison de la technique d'enregistrement de la préparation électrophysiologique et des étapes nécessaires pour collecter les composés volatils de la phase gazeuse. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur le traitement olfactif des bourdons, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les facteurs de maladies impliquant des moustiques ou des punaises triatomines, ou encore les ravageurs des cultures tels que les pucerons ou les papillons. Pour cette procédure, préparez une électrode de référence constituée d'un fil de tungstène monté sur un micromanipulateur en second lieu.

Le micromanipulateur est équipé d'une électrode multicanal, telle qu'un fil enroulé, une électrode tétrade ou une électrode multicanal en silicium, reliée à un préamplificateur et à un chromatographe en phase gazeuse dont la sortie est connectée à une table BNC blindée. La sortie du détecteur du CG est reliée au système d'amplification et d'acquisition de données de manière à ce que les signaux neuronaux et ceux du CG soient synchronisés. Dans cet exemple, le gaz vecteur du CG est de l'hélium et la colonne CG utilisée est une colonne DB-5.

Le CG utilise une entrée à rampe partagée dont la température est réglée à 200 degrés Celsius et dont la température du détecteur à ionisation de flamme est fixée à 230 degrés Celsius. Après chauffage des échantillons dans le CG, l'effluent provenant de la colonne est divisé en parts égales entre le détecteur à ionisation de flamme et l'antenne B à l'aide d'un raccord en verre en forme de Y. Dans cet exemple, le CG sert à acheminer les composés volatils recueillis par absorption dynamique à partir des fleurs de Mimus Lewis eye, une plante sauvage alpine originaire de Californie.

Alternativement, au lieu d'utiliser la cg, des composés volatils uniques ou des mélanges de composés peuvent être délivrés par des impulsions d'air. Envoyés à travers une seringue en verre séparée contenant un morceau de papier filtre sur lequel les composés ont été déposés. Les impulsions d'air sont déviées d'un flux d'air constant à l'aide d'une valve actionnée par un solénoïde commandée par ordinateur.

Commencez les préparatifs en coupant environ un centimètre à l'extrémité d'une pipette d'un millilitre. Placez un bourdon dans la base de la pipette et poussez-le doucement vers l'autre extrémité jusqu'à ce que seule la tête soit exposée. À l'aide de cire dentaire fondue, réalisez un moule autour de la tête exposée.

La cire doit adhérer aux yeux composés afin d'immobiliser complètement la tête, mais elle ne doit pas toucher l'antenne si nécessaire. Utilisez de petites épingles pour immobiliser les antennes. Ensuite, pratiquez une incision en forme de fenêtre carrée dans la capsule céphalique à l'aide d'une lame fine, comme un micro-scalpel.

Commencez à couper juste derrière l'antenne et à côté de l'un des yeux composés. Tracez une ligne droite entre les yeux. Ensuite, coupez en direction dorsale jusqu'à ce que la capsule céphalique s'incurve vers le thorax.

Poursuivez la coupe jusqu'à l'extrémité opposée de la capsule céphalique. Enfin, revenez au point de départ pour compléter le carré. Utilisez une pince pour retirer la cuticule.

La cuticule adjacente à l'antenne doit être retirée, sinon elle gênera l'électrode dès que le cerveau sera exposé. Superfuser immédiatement le tissu avec du sérum physiologique pour insectes. Veiller à bien exposer les lobes antennaires.

Ensuite, utilisez soigneusement une paire de pinces très fines pour retirer la gaine périneurale située juste au-dessus des lobes antennaires. Veillez à ne pas percer le cerveau de l'abeille avec les pinces. La préparation de l'abeille est maintenant prête pour l'enregistrement électrophysiologique.

Commencez par fixer l'abeille préparée à une pince montée sur une base magnétique. Maintenez-la perfusée avec une solution saline pour insectes provenant d'un réservoir équipé d'un régulateur de débit. Insérez ensuite l'électrode de référence dans le tissu cérébral controlatéral.

Ensuite, insérez l'électrode multicanal dans les lobes anténaux de l'abeille. Une fois les électrodes en place, attendez de 30 à 60 minutes pour que les enregistrements se stabilisent.

Pendant ce temps, préparez-vous à détecter les potentiels extracellulaires des neurones en appliquant également un seuil. Un seuillage manuel des canaux d'enregistrement individuels peut être nécessaire pour certains canaux en raison du bruit présent dans les canaux d'enregistrement. Ensuite, vérifiez que la rampe de température de l'analyse en chromatographie en phase gazeuse est correcte.

Dans cet exemple, la température démarre à 50 degrés Celsius pendant quatre minutes, puis augmente de 10 degrés par minute jusqu'à une température finale de 220 degrés Celsius, ou est maintenue pendant six minutes. Lorsque les formes d'onde des unités dans les canaux d'enregistrement sont devenues constantes, les enregistrements neuronaux sont considérés comme stables. Une fois stabilisés, charger la seringue avec l'odeur du headspace floral et injecter l'odeur dans le port d'injection en tête du gc.

Ensuite, commencez immédiatement l'enregistrement à partir des électrodes dès que l'analyse en GC est terminée. Laissez le préparatif se reposer pendant cinq à quinze minutes. Ensuite, injectez un autre échantillon dans le GC ou stimulez le préparatif à l'aide de composés volatils individuels ou de mélanges de composés.

Si, à un moment quelconque, l'activité spontanée cesse soudainement ou change, vérifiez la perfusion de solution saline et laissez le prélèvement se reposer pendant 15 minutes. Si l'activité ne retrouve pas son niveau précédent, mettez le prélèvement au rebut. Après l'expérience, fixez le cerveau en laissant les sondes en place dans le tissu, puis excisez le cerveau, éliminez le fixateur et déshydratez le cerveau.

Les emplacements des canaux d'enregistrement peuvent ensuite être identifiés par microscopie confocale à partir du parfum floral de Mimus Luci. Le nombre total de composés volatils est en cours d'analyse. La CG comprend généralement entre 60 et 70 composés.

L'odeur de Mimus Luci est principalement composée de monoterpénoïdes, notamment de bêta-myosine et d'alpha-pinène. Le reste de l'odeur est constitué de composés volatils à six atomes de carbone. Plusieurs préparations ont été stimulées avec trois microlitres d'extrait oculaire de Mimus Lewis.

Cet enregistrement provenant de l'une des huit unités neuronales enregistrées par l'électrode multicanal montre à quel point un neurone est sélectif pour des composés volatils spécifiques. Dans cet exemple, le composé présenté est le dine. Voici les réponses de huit unités neuronales.

Environ la moitié de l'ensemble était inerte. Cela est surprenant compte tenu de la diversité des composés volatils évoqués dans l'espace floral, mais ce phénomène est reproductible entre différentes préparations et est rapporté par d'autres études. Le taux de décharge normalisé des unités réactives montre une forte sélectivité pour un groupe d'odeurs.

Les odorants mis en évidence par les flèches ont provoqué les réponses les plus marquées. Il s'agit de la démine et du trans béta osaïne. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de votre insecte pour l'expérience, puis de la réalisation de l'expérience à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à un enregistrement multicanal.

L'objectif est alors d'identifier des odorants putativement actifs sur le comportement au sein d'un bouquet complexe. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est correctement effectuée en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme des tests comportementaux avec les odorants identifiés, peuvent être réalisées afin de déterminer pleinement l'efficacité des composés volatils dans la médiation de la réponse comportementale de l'insecte.