Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

L'objectif général de cette procédure est d'observer la répartition des génomes viraux dans les cellules en division. Cela est réalisé en premier lieu en construisant un plasmide pouvant être visualisé par microscopie de fluorescence. Ici, un plasmide est conçu pour inclure des répétitions en tandem de la séquence opérateur de la lactose, ou LAC O. La deuxième étape consiste à introduire le plasmide dans des cellules en division, suivie de l'infection des cellules par un rétrovirus codant pour le répresseur de la lactose, ou lac eye, fusionné à une protéine fluorescente.

Les protéines de fusion du répresseur de lactose se lieront spécifiquement aux séquences opérateurs du lactose présentes sur le plasmide sub. Les cellules sont observées par microscopie à fluorescence afin de suivre les plasmides individuels au cours de plusieurs cycles cellulaires. En fin de compte, les images obtenues sont traitées pour déterminer comment les génomes viraux sont maintenus dans les cellules en division.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative, le transfert Southern ou l'hybridation in situ par fluorescence, est qu'elle permet d'observer des plasmides individuels à plusieurs moments dans le temps. Pour permettre la visualisation du plasmide par microscopie de fluorescence, des techniques standards de clonage moléculaire sont utilisées afin d'introduire un fragment d'ADN contenant environ 250 copies de la séquence opérateur de la lactose, ou LAC O, dans le plasmide. Dans cet exemple, le plasmide est un cosmide d'environ 170 paires de kilobases qui contient le génome complet du virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi, ou KSHV, et code une résistance à l'hygromycine.

Introduire le plasmide ADN contenant le LAC O dans les cellules de mammifères HeLa et SLK par transfection dans des boîtes de 60 millimètres, en incubant les cellules avec 10 microgrammes de plasmide purifié, 25 microlitres de lipectamine, 2000 0,5 millilitres d'Opti-MEM et 3,5 millilitres de DMEM pendant quatre heures. Changer le milieu par du DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal et laisser les cellules se rétablir pendant 48 heures.

Ensuite, ensemencer les cellules transfectées à faible densité dans de grandes boîtes de culture et les maintenir pendant trois semaines dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 300 microgrammes par millilitre d'hygromycine afin de sélectionner le plasmide introduit. Utiliser des morceaux de bandes stériles et du papier filtre imbibé pour transférer les colonies résistantes à l'hygromycine vers de nouvelles boîtes de culture. Placer les boîtes dans l'incubateur après une à deux semaines, lorsque les clones transfectés ont grandi suffisamment pour recouvrir la boîte, puis isoler l'ADN pour une digestion par des enzymes de restriction et un transfert Southern, afin de vérifier que le polymère du plasmide LAC O est homogène et de la taille attendue. Ce transfert type montre que le polymère LAC O du clone un est homogène et identique à celui du témoin positif.

Dans la voie sept, si le plasmide n’a pas été conçu pour exprimer une fusion de la répresseur du lactose lac eye, infecter les clones appropriés avec un rétrovirus codant pour lac eye fusionné à une protéine fluorescente rouge, telle que lac eye, TD tomate. TD tomate est choisi à la place des protéines fluorescentes plus proches du vert afin de minimiser la phototoxicité qui résulterait de multiples expositions répétées sur de longues périodes. Une fois la protéine de fusion LAC eye introduite, cultiver les cellules en présence de 200 microgrammes par millilitre de IPTG afin d’empêcher les protéines de fusion de se lier à l’ADN. L’un des aspects les plus critiques de cette procédure consiste à obtenir des clones présentant une intensité de fluorescence appropriée.

Un grand nombre de clones doit être analysé afin d'identifier ceux présentant une fluorescence optimale. Cultivez les cellules pendant au moins trois jours pour permettre l'expression de la protéine LAC eye TD tomato. Analysez les clones afin d'identifier ceux exprimant des niveaux optimaux de LAC eye TD tomato, produisant des signaux nets avec un fond minimal de protéine de fusion non liée. Entre 24 et 48 heures avant l'acquisition d'images, plaquez les cellules exprimant LAC I TD tomato dans une boîte de 35 millimètres à fond en verre, à une densité inférieure à 10 % de confluence. Cela permettra aux paires de cellules de se diviser en colonies de huit à seize cellules sans chevauchement, une à trois heures avant le début de l'observation.

Rincez la plaque trois fois avec du milieu de culture ne contenant ni drogues sélectives ni IPTG. Ce lavage élimine les cellules non viables et permet aux protéines de fusion lac eye de se lier aux cellules LAC présentes dans les plasmides. Remplacez le milieu de culture par deux millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 25 millimolaires de Hippies. Incubez pendant une à trois heures. Juste avant l’imagerie, remplacez le couvercle de la boîte de culture par du papier d’incubation tendu dans un anneau de montage adapté à une boîte de 35 millimètres.

Cette couverture empêchera l'évaporation du milieu de culture, qui entraînerait une augmentation de la concentration en sels au fil du temps et provoquerait la mort des cellules. Le système d'imagerie utilisé dans cette expérience est constitué d'un microscope inversé Zeiss Axio 200 M, équipé d'une platine motorisée et d'une caméra EM CCD pour une détection sensible des signaux. La lumière d'excitation fluorescente est fournie par la LED blanche neutre d'un système Collibra.

Le système d'imagerie est contrôlé par un logiciel permettant des acquisitions automatisées d'images à intervalles longs avec plusieurs piles Z. Un incubateur de plateau est utilisé pour maintenir les cellules à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère contenant 5 à 10 % de dioxyde de carbone, dans une chambre humidifiée. Utilisez un collier chauffant pour l'objectif à immersion dans l'huile afin d'empêcher l'objectif de pomper.

La chaleur provenant de l'échantillon permet de laisser suffisamment de temps au système pour atteindre une température stable. Afin de minimiser les artefacts liés aux mouvements pendant l'expérience, le système d'imagerie doit être placé sur une table anti-vibrations afin d'être isolé des secousses. Pour commencer la procédure de visualisation de l'ADN marqué, utiliser l'imagerie en contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer les cellules et déterminer le plan focal correspondant au sommet et à la base des cellules dans plusieurs champs de vision. Dans chaque champ, se déplacer vers un plan focal situé approximativement à un tiers de la profondeur à partir du sommet de la cellule, puis enregistrer les coordonnées x, y, Z dans la liste des positions de la platine sauvegardées.

Chaque position enregistrée servira de centre à une série d'images à capturer dans le logiciel de contrôle du microscope ; définissez une série d'images à effectuer à chaque position enregistrée de la platine. Définissez un nombre de coupes suffisant pour capturer entièrement la cellule, avec des coupes supplémentaires au-dessus et au-dessous des plans où se trouvent les cellules. Choisissez un pas en Z compris entre 0,35 et 0,50 micromètre afin d'assurer un échantillonnage approximatif de Nyquist dans la dimension Z. Ces coupes permettent de suivre les déplacements cellulaires au cours du cycle cellulaire et sont également utilisées lors du traitement post-acquisition des piles d'images.

Cela donnera lieu à une pile de 40 à 60 images selon l'épaisseur des cellules. Définissez une expérience en série temporelle afin d'acquérir une image en champ clair des Zacks à des intervalles de 30 minutes, et des images de fluorescence à des intervalles de 10 à 60 minutes. N'utilisez pas l'imagerie DIC pendant l'expérience, car elle nécessite plus de lumière que l'imagerie standard en champ clair, ce qui pourrait exposer inutilement les cellules à une phototoxicité au cours d'expériences prolongées.

Démarrer l'expérience contrôlée par logiciel. S'assurer que le système n'est pas perturbé pendant l'expérience. Une fois toutes les images de l'expérience acquises, examiner les images pour chaque Zack et chaque point temporel, puis rogner les zones inutiles des images afin de réduire le temps de traitement informatique.

À l'étape suivante, réaffectez l'intensité du signal au pixel d'origine dans chaque pile Z. Utilisez un algorithme de déconvolution dans le logiciel Axio Vision basé sur la fonction d'étalement du point mesurée du système d'imagerie. Le résultat de la déconvolution est affiché ici.

Examinez les images pour suivre les variations d'intensité et les mouvements des plasmides au cours du cycle cellulaire ainsi que la répartition des plasmides entre les cellules filles. Ces images, générées par calcul à partir de plusieurs plans Z où se situent les différents signaux, montrent que les noyaux des cellules HELOC exprimant le TD tomate LAC œil sont fluorescents en raison du signal de localisation nucléaire présent sur la protéine de fusion, ce qui la dirige vers le noyau. En l'absence d'I-P-T-G-K-S-H-V, les génomes contenant des séquences LAC O recrutent de nombreuses copies de la protéine fluorescente et apparaissent comme des signaux intenses par rapport à l'intensité de fond du noyau.

En revanche, en présence d'IPTG, les protéines fluorescentes LAC empêchent la liaison à leur séquence de reconnaissance lacO ; des projections d'intensité maximale de Zack ont été acquises sur une cellule au cours du cycle cellulaire à cinq moments différents. Les points d'un expérience représentative sont montrés sur cette figure. Les génomes viraux marqués de façon fluorescente dans la cellule, visibles dans le panneau A, sont synthétisés comme indiqué dans le panneau B. Les génomes viraux sont ensuite répartis entre les cellules filles lors de la division cellulaire, tel qu'observé dans les panneaux C, D et E. Le cycle cellulaire de cellules saines HELOC dure environ 24 heures, et les cellules filles s'attachent généralement proches l'une de l'autre et se divisent ensuite simultanément lors du prochain cycle cellulaire.

À l'aide de ce protocole, on peut suivre les génomes viraux dans la cellule sur plusieurs générations lors de la mise en œuvre de cette procédure. Il est important de surveiller l'aspect morphologique des cellules au cours du temps de génération afin de s'assurer que les cellules restent en bon état tout au long de l'expérience.