Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir des données de microscopie optique et électronique corrélatives, ou CLEM, en combinant des informations immunocytochimiques de fluorescence avec la morphologie ultrastructurale de la microscopie électronique à transmission dans une seule image. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunocytochimie et de la pathologie, telles que la structure subcellulaire à laquelle une protéine d’intérêt particulière est associée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise la même sonde de nanoparticules à points quantiques pour obtenir à la fois le signal de microscopie en direct de la protéine cible et la localisation structurelle de la microscopie électronique.

Après avoir fixé, intégré et sectionné le tissu tumoral du somatostatinome humain conformément au protocole de texte, préparez une solution adhésive de section en plaçant 20 centimètres de ruban adhésif transparent dans une bouteille de cinq millilitres contenant 2,0 millilitres d’acétone et laissez-la reposer pendant 10 minutes. Retirez le ruban adhésif et trempez une grille de nickel dans la solution, puis retirez la grille et laissez-la sécher à l’air. Une fois sec, utilisez le côté émoussé de la grille pour prélever une section ultra fine.

Il est essentiel d’établir le temps de gravure correct pour la formulation de résine choisie. 30 minutes fonctionnent bien pour cette formulation, mais il peut être nécessaire de les recalculer pour les formulations plus dures ou plus douces. Préparez un millilitre de solution de gravure de métaperiodate de sodium saturé fraîche dans de l’eau distillée et placez les gouttelettes de la solution sur une surface de film de laboratoire propre.

Placez des grilles complètement sèches avec des sections sur les gouttelettes et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les grilles dans des gouttelettes d’eau distillée pendant 60 secondes pour les laver. Pour effectuer un marquage d’anticorps et de points quantiques, ou QD, sur une surface de film de laboratoire propre, pipetez des gouttes de glycène 0,05 molaire et de PBS.

Placez les grilles sur les gouttelettes et incubez pendant 10 minutes pour bloquer l’aldéhyde résiduel sur les sections. Pour retirer le bloc d’aldéhyde, épongez brièvement le bord de la grille. Placez ensuite la grille sur une gouttelette d’un pour cent de sérum de chèvre normal, ou NGS, et d’un pour cent de BSAC dans PBS pendant 10 minutes.

Préparez un millilitre de solution bloquante en ajoutant 10 microlitres de NGS et 100 microlitres de BSAC à 890 microlitres de PBS. Ensuite, conditionnez les sections en les plaçant sur une gouttelette de diluant d’anticorps pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez un diluant d’anticorps pour diluer l’anticorps polyclonal anti-somatostatine de un à 10, et placez les grilles sur des gouttelettes de la solution.

Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, retirez le réactif d’anticorps en épongeant le bord de la grille. Ensuite, utilisez un diluant à base d’anticorps pour laver les sections deux fois pendant cinq minutes chacune.

Après avoir dilué l’anticorps secondaire de un à 10 et préparé des gouttes, incubez les grilles sur les gouttelettes à température ambiante pendant une heure. Ensuite, retirez la solution d’anticorps et lavez les sections deux fois. Diluez les QD conjugués à la streptavidine de un à 10 et incubez les échantillons sur des gouttes de la solution dans l’obscurité, à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, utilisez un diluant à base d’anticorps pour laver les grilles deux fois, à chaque fois pendant cinq minutes, et épongez le bord des grilles. Ensuite, lavez les grilles à l’eau distillée pendant deux minutes avant de sécher les bords par épongement. Placez la section de la grille immunocolorée dans une gouttelette d’eau sur une lame de verre et utilisez une lamelle en verre pour la couvrir.

Pour effectuer la microscopie optique à fluorescence, insérez un cube de filtre avec les caractéristiques suivantes et utilisez un éclairage LED de 365 nanomètres. Placez la section immunomarquée sur la platine du microscope d’immunofluorescence. Utilisez la microscopie optique pour évaluer le modèle d’étiquetage, le niveau de tout étiquetage non spécifique et pour établir que les contrôles négatifs sont clairs.

Ensuite, identifiez les retours sur investissement par rapport aux barres de la grille. Ensuite, réglez un appareil photo numérique couleur sur FL auto color et réglez la balance des blancs sur 3, 200 K.Réglez l’appareil photo sur le mode d’exposition automatique avec un réglage gamma compris entre 0,45 et 1,00 pour optimiser l’apparence des images, et un gain analogique réglé sur un X.Cliquez sur l’icône de l’appareil photo dans l’interface graphique du logiciel ZEN Two Light pour vivre. Ensuite, concentrez-vous sur l’image et cliquez sur Snap dans l’interface graphique du logiciel ZEN Two Light pour capturer l’image dans le magasin de cadres.

Enregistrez les images sous forme de fichiers tf pour éviter la compression et la pixellisation. Préparez une impression montrant la position du retour d’intérêt par rapport aux barres de la grille ou à d’autres points de repère tissulaires significatifs. Retirez ensuite la grille de la diapositive, lavez-la à l’eau distillée et épongez doucement les bords pour les sécher.

Pour effectuer la microscopie électronique à transmission, transférez la grille au microscope pour l’examiner à l’aide d’une tension d’accélération de 100 kilovolts. Commencez par un faible grossissement d’environ 1 400X pour naviguer sur la grille et trouver les zones d’intérêt avec celles trouvées avec la microscopie optique. Observez les QD individuels à un grossissement de 70, 000X ou plus.

Ils apparaîtront sous la forme de structures cristallines irrégulières avec une densité électronique modérée. Ensuite, à l’aide d’un appareil photo numérique doté d’un capteur monochrome de 1 392 x 1 040 pixels dans l’interface graphique du logiciel d’imagerie, cliquez sur l’icône de l’appareil photo pour activer et acquérir des images. Déplacez l’icône de l’appareil photo en position d’arrêt pour stocker l’image dans le magasin de cadres.

Pour réaliser l’imagerie CLEM, utilisez une empreinte de l’imagerie de microscopie optique pour localiser les zones d’intérêt correspondantes par TEM. Les caractéristiques architecturales des tissus sont utiles pour la navigation dans la section. Capturer une image du retour sur investissement correspondant par TEM.

Ensuite, pour préparer une image CLEM, assurez-vous que l’image TEM est correctement orientée et agrandie à la même taille et à la même résolution que l’image du microscope optique, dans ce cas, 300 pixels par pouce. Augmentez la taille de la toile d’image de microscopie optique pour doubler sa taille. Copiez et collez ensuite l’image TEM à côté de l’image de fluorescence.

Pour créer une superposition de fluorescence dans Photoshop CS2, cliquez sur l’outil de sélection rectangulaire, sélectionnez l’image fluorescente et créez un calque dupliqué à partir de celle-ci. Ajustez les options de fusion du style de calque à 30 à 40 % de transparence. Cliquez ensuite sur l’outil de déplacement et faites glisser la couche de superposition de fluorescence sur l’image TEM correspondante, puis alignez les images.

Après avoir aligné les images, aplatissez-les pour produire la superposition finale. Utilisez ensuite l’outil de sélection rectangulaire pour sélectionner la nouvelle image de superposition et la copier sur une nouvelle toile. Enfin, enregistrez l’image en tant que fichier tf.

Dans cette image de microscopie à fluorescence, les cellules tumorales individuelles du somatostatinome contiennent d’abondants granules sécrétoires et ont été marquées positivement pour l’hormone somatostatine. Les noyaux sont apparus comme des trous noirs et, à faible grossissement, une fluorescence QD orange granulaire d’intensité variable a été observée dans le cytoplasme. Le retour d’intérêt choisi par la microscopie optique a été reconnu et imagé à l’aide de la MET en se référant à une image de microscopie optique 20X, comme indiqué ici.

À un grossissement plus élevé, la cellule présente une fluorescence brillante et un marquage QD intense dans les granules cytoplasmiques. La superposition des données de fluorescence sur les images TEM, comme dans cet exemple, suggère qu’un marquage positif fort correspond à des granules contenant un matériau modérément dense en électrons à l’intérieur de la membrane limitante des vésicules. Enfin, comme on le voit ici à un grossissement plus élevé, les granules modérément denses en électrons ont montré un immunomarquage nanocristallin QD intense.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de procédure, il est important de se rappeler de manipuler les grilles avec soin, par les bords uniquement. Toucher la section tout en ramassant la grille peut détacher la section de la grille.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunomarquage multiplex peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que votre protéine d’intérêt co-localise avec une autre protéine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pathologie pour explorer la localisation des protéines dans le processus d’archivage des tissus humains pour la microscopie électronique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner les informations immunocytochimiques de la microscopie optique à fluorescence avec l’ultrastructure de la microscopie électronique à transmission.

N’oubliez pas que travailler avec du tétroxyde d’osmium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection, le travail dans une hotte et l’élimination appropriée des déchets doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.