Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

L’objectif général de ce protocole est de décrire l’utilisation du CMH peptidique photoactivable pour induire une signalisation polarisée dans les lymphocytes T. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la transduction des signaux des cellules immunitaires, telles que la façon dont les lymphocytes transduisent des signaux localisés rapides, puis montent des réponses cellulaires polarisées à ces signaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un contrôle spatio-temporel de la signalisation des lymphocytes T.

Pour ce faire, il fixe le moment et l’emplacement précis de l’activation des récepteurs des lymphocytes T. La démonstration de la procédure sera faite par Elisa Sanchez, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Commencez par ajouter de la poly-L-lysine biotinylée, ou bio-PLL, diluée de un à 500 dans de l’eau distillée déminéralisée dans un verre de couverture à huit compartiments.

Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, laver à l’eau distillée déminéralisée, puis sécher pendant deux heures à température ambiante. Bloquez les surfaces revêtues de bio-PLL avec un tampon de blocage composé d’une solution saline tamponnée HEPES avec 2 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, retirer le tampon de blocage des surfaces revêtues de bio-PLL sans laisser les puits sécher. Ajoutez ensuite la streptavidine et incubez à quatre degrés Celsius. Au bout d’une heure, lavez les surfaces revêtues de HBS.

Remplissez et retournez les puits de la chambre quatre à cinq fois, en retirant le HBS des puits. Ne laissez pas les puits sécher. Ajoutez le peptide photoactivable biotinylé spécifique, les ligands du complexe majeur d’histocompatibilité et les molécules d’adhésion pour les lymphocytes T CD4 positifs ou les cellules CD8 positives aux surfaces revêtues de bio-PLL.

Protéger de la lumière et incuber pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver comme avant et laisser dans HBS jusqu’au moment de semer. Enfin, ajoutez 200 000 lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs exprimant le TCR approprié dans les puits appropriés et laissez les cellules adhérer à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois que les cellules se sont fixées et se sont répandues à la surface, elles sont prêtes pour la photoactivation et l’imagerie. Utilisez un microscope à fluorescence à réflexion interne totale inversée équipé d’un objectif 150X compatible UV pour l’acquisition d’images. Surveillez les sondes dans les canaux vert et rouge à l’aide de lasers d’excitation de 488 nanomètres et 561 nanomètres, respectivement.

Après avoir monté la lame de chambre contenant les lymphocytes T, ajustez les paramètres du microscope pour obtenir un éclairage TIRF ou d’épifluorescence, si nécessaire. En mode Live, sélectionnez un champ de cellules qui expriment les sondes fluorescentes d’intérêt. Établissez des régions à l’échelle du micron pour la photoactivation sous les cellules individuelles à l’aide d’un contrôle logiciel.

Ensuite, lancez l’acquisition. En règle générale, 80 points de temps sont nécessaires avec un intervalle de cinq secondes entre chacun. Cela laisse du temps pour des expositions séquentielles de 488 nanomètres et de 563 nanomètres dans le cas d’expériences bicolores.

Ensuite, après avoir acquis 10 points de temps, photoactivez les régions sélectionnées en ouvrant l’obturateur à diaphragme numérique pendant une à 1,5 seconde. Une fois le laps de temps terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répétez le processus. Commencez par déterminer l’intensité de fluorescence d’une région d’arrière-plan à l’extérieur de la cellule à utiliser pour la correction d’arrière-plan.

Dessinez une région carrée de la taille d’un micron à l’extérieur de la cellule et créez un masque. Pour déterminer l’intensité de fluorescence, cliquez sur Analyser, Statistiques du masque. Sélectionnez Intensité moyenne de fluorescence et exportez les valeurs.

Déterminez l’intensité de fluorescence dans la région photoactivée pour chaque point temporel. Sélectionnez Masque pour mettre en surbrillance la région qui a été photoactivée. Pour déterminer l’intensité de fluorescence, cliquez sur Analyser, Statistiques du masque.

Sélectionnez Intensité moyenne de fluorescence et Exporter les valeurs. Obtenez les coordonnées X et Y du centre de la région photoactivée en sélectionnant Masque pour mettre en surbrillance la région photoactivée. Une fois la région de photoactivation mise en surbrillance, sélectionnez Analyser, Masquer les statistiques, Centre de la zone et Exporter les valeurs.

Déterminez les coordonnées X et Y de la sonde fluorescente d’intérêt. Sélectionnez Suivi manuel des particules et cliquez sur la sonde fluorescente qui vous intéresse au fil du temps. Une fois que tous les points temporels ont été suivis, sélectionnez Analyser, Masquer les statistiques, Centre de la zone et Exporter les valeurs.

Les lymphocytes T ont été fixés à un verre de couverture chambré contenant du MCC-IEFK photoactivable. C1-GFP, une sonde pour le second messager lipidique DAG, a été imagé à l’aide de la microscopie TIRF et de la tubuline RFP en mode épifluorescence. La photoactivation localisée de la surface sous le lymphocyte T induit l’accumulation de DAG dans la zone irradiée.

S’ensuit en quelques secondes la réorientation du centrosome vers la même région. L’accumulation de C1-GFP peut être quantifiée en calculant l’intensité de fluorescence normalisée après correction du bruit de fond au centre de la région photoactivée au fil du temps. La réorientation du centrosome en réponse à la photoactivation peut être quantifiée en calculant la distance entre le centrosome et le centre de la région photoactivée en fonction du temps.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une journée si elle est exécutée correctement. Nous générons généralement 15 à 20 films en accéléré pour l’analyse dans ce laps de temps. Cette approche a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la cinétique et la polarisation précises de la signalisation d’activation dans les lymphocytes T.

Il a également été adapté pour étudier la signalisation inhibitrice dans les cellules tueuses naturelles. En conséquence, nous avons maintenant une meilleure compréhension de la façon dont les interactions cellulaires immunitaires communicatives sont assemblées et dissoutes.