Traçage de lignée et analyse clonale dans le développement du cortex cérébral à l’aide de l’analyse mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM)
8 mai 2020
Un protocole pour effectuer le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau d’une seule cellule à l’aide de l’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) est présenté. L’analyse clonale de MADM fournit un cadre quantitatif pour mesurer le comportement prolifératif, la sortie cellulaire, et la relation de lignée des ancêtres individuels et de leurs cellules de fille.
Mosaic Analysis avec double marqueurs technologie est une méthode puissante qui peut fournir des informations hautement quantitatives sur le comportement de prolifération et les sorties de cave des cellules souches individus. Une caractéristique unique de cette technique, c’est qu’elle permet le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau de la cellule unique. Pour induire des événements de recombinaison MADM chez des souris expérimentales, utilisez une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de calibre 25 pour livrer une seule injection de Tamoxifène Intraperitoneal dans une période jusqu’à la mère enceinte. De l’analyse clonale MADM aux points de temps postnatals. Les jours embryonnaires 18 à 19, placer une souris enceinte dans la position supine et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Faire une petite incision dans la peau dans le bas-ventre au-dessus de l’utérus et faire une deuxième incision à travers les muscles et la paroi musculaire abdominale pour révéler le péritoine. Utilisez des ciseaux pour séparer l’utérus des tissus environnants et placez l’utérus intact dans un gant avec de l’eau chaude. Ensuite, utilisez des ciseaux à pointe fine et les doigts pour ouvrir soigneusement les parois utérine pour libérer les embryons. Nettoyez les chiots en appuyant doucement sur la poitrine de temps en temps pour commencer à respirer avant de transférer les animaux prénatals à une mère adoptive. Pour recueillir le tissu clone MADM neural placer un animal anesthésié dans la position supine sur un plateau de chirurgie de perfusion et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision à travers la peau et une incision à travers la couche musculaire. Lorsque la cavité thoracique est visible, renifler et soulever le diaphragme pour révéler le cœur et soigneusement couper et épingler la cage thoracique au tray.insert chirurgical une aiguille reliée à un tube pompe périssaliste rempli de PBS dans le ventricule inférieur gauche du cœur et utiliser de petits ciseaux Iris pour faire une incision dans l’extrémité postérieure de l’oreillette droite. Perfuser le système cardiovasculaire avec le PBS suivi immédiatement par perfusion avec de la glace fraîchement préparée froid 4%paraformaldéhyde dans PBS. Lorsque la perfusion est terminée, enlever le cerveau par dissection soigneuse et placer l’organe récolté dans au moins cinq fois le volume cérébral de 4% de paraformaldéhyde frais pendant la nuit à 4
Aperçu
Cette étude présente un protocole de traçage de lignée et d'analyse génétique fonctionnelle de gènes candidats au niveau de la cellule unique en utilisant l'analyse en mosaïque avec deux marqueurs (MADM). L'analyse clonale MADM permet la mesure quantitative du comportement prolifératif et du rendement cellulaire de progéniteurs individuels ainsi que de leurs cellules descendantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Tracage lignagique
- Analyse génétique
- Biologie des cellules souches
Contexte
- La technologie MADM est essentielle pour comprendre la prolifération cellulaire.
- La méthode permet le traçage au niveau de la cellule unique.
- Ses applications incluent l'évaluation des produits cellulaires et des relations lignagères.
Méthodes utilisées
- Analyse en mosaïque avec doubles marqueurs (MADM)
- Modèle expérimental : souris
- Les techniques comprennent des injections intrapéritonéales et la perfusion de tissus.
Résultats principaux
- A permis un examen détaillé du comportement des cellules progénitrices.
- A fourni des informations sur les relations lignagères des cellules filles.
- A démontré une méthode fiable pour l'analyse génétique fonctionnelle.
Conclusions
- La présente étude fournit un protocole complet pour l'utilisation de la MADM dans l'analyse génétique.
- Les résultats apportent une contribution importante au domaine de la biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'analyse en mosaïque avec doubles marqueurs (MADM) permet un traçage de lignée et une analyse clonale à une résolution unicellulaire sans précédent dans le cortex cérébral en développement, répondant directement au défi que représente la cartographie du destin et des schémas de division des cellules souches neuronales. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive de la validation précoce des cibles en neurodéveloppement et soutient la réduction des risques mécanistiques dans les décisions portant sur les portefeuilles de recherche et développement du SNC. Les résultats quantitatifs et qualitatifs fournis par la MADM en font un outil essentiel pour l'interrogation génétique fonctionnelle dans les chaînes de R&D axées sur la neurobiologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation précise des transitions de lignée et des modes de division des cellules souches neuronales.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des gènes candidats dans les voies de neurodéveloppement.
- Offre une détection mécanistique des risques en distinguant in vivo les sous-clones contrôle et mutants.
- Facilite la sélection de cibles fiables pour les programmes thérapeutiques du système nerveux central.
Développement de tests et de criblages
- Génère des cartes de lignage unicellulaires validées pour le criblage phénotypique en aval.
- Fournit des lectures reproductibles et quantitatives de la prolifération des progéniteurs et de la spécification du destin cellulaire.
- Facilite la standardisation des tests en permettant une analyse comparative au sein du même environnement tissulaire.
- Prépare des systèmes biologiques robustes pour l'évaluation de composés dans des contextes de développement neuronal.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats du traçage lignéaire avec la formation de circuits neuronaux pertinents pour la maladie.
- Permet une continuité entre la manipulation génétique en phase de découverte et la validation dans un modèle préclinique.
- Facilite l'essor ciblé des cibles du SNC fondé sur des preuves fonctionnelles in vivo.
- Apporte des informations translationnelles sur les biomarqueurs grâce à l'analyse clonale des progéniteurs neuronaux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le traçage de lignée basé sur MADM s'intègre de la découverte précoce à l'identification des candidats et à la validation préclinique dans les pipelines axés sur le SNC.
- Biologie de la découverte : Permet un test d'hypothèses à haute résolution des destinées cellulaires et des schémas de division des cellules souches neuronales.
- Criblage : Fournit des données quantitatives et reproductibles sur la lignée cellulaire pour le développement d'essais et le criblage de composés.
- Analyse : Propose des sorties optiques et statistiques permettant de comparer les comportements des progéniteurs contrôles et mutants.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes fondamentales et les modèles précliniques en cartographiant les issues des lignées in vivo.
- Réutilisation en milieu professionnel : Adaptable à toute niche de cellules souches murines munie de promoteurs CreERT2 appropriés, favorisant l'extensibilité de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la lignée neuronale.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles de traçage des lignées et d'analyse clonale afin d'assurer la reproductibilité et l'extensibilité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et réduit les risques biologiques tardifs dans les portefeuilles du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles neurodéveloppementales fondée sur des données fonctionnelles in vivo.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation génétique, en traçage lignagique in vivo et en dissection neuroanatomique.
- Exige un accès à des modèles murins porteurs de promoteurs CreERT2 et à une infrastructure d'imagerie avancée.
- Implique une standardisation interéquipes pour une analyse clonale et une interprétation des données reproductibles.
- Adaptable à diverses niches de cellules souches moyennant des promoteurs génétiques adéquats et des protocoles de manipulation des tissus appropriés.
- Limité aux systèmes murins pour lesquels les outils génétiques et l'accès aux tissus sont réalisables.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
